薯蕷皂苷抗肝腦缺血再灌注損傷的生物學活性及分子機制研究.pdf

1、目的:考察薯蕷皂苷(dioscin)抗肝腦缺血再灌注損傷的生物學活性并探討可能的分子作用機制。
　　方法:(1)在薯蕷皂苷抗肝缺血再灌注損傷(hepatic I/R injure)研究中，采用70％Wistar大鼠肝缺血模型。預防組大鼠隨機分假手術組、模型組和高中低劑量給藥組(薯蕷皂苷，60、40和20 mg/kg)，每組10只，每天口服給予薯蕷皂苷1次，連續(xù)給藥7天;治療組大鼠隨機分假手術組、模型組和給藥組(薯蕷皂苷，60 mg

2、/kg)，每組20只，手術前2h口服給予薯蕷皂苷1次，術后每天給藥一次。檢測血清ALT、AST水平，結合組織病理學和生存率等指標來評價薯蕷皂苷對肝缺血再灌注損傷的保護作用;測定肝組織中SOD、MDA、CAT、GSH-Px、 GSH、NO、iNOS和TNOS含量來考察薯蕷皂苷的抗氧化能力;采用DAPI、TUNEL和DAB分析法考察薯蕷皂苷的抗凋亡作用;采用免疫組織化學、western blotting及real-time PCR方法考察薯

3、蕷皂苷對凋亡和炎癥信號通路相關蛋白和基因表達影響。
　　(2)在薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷(cerebral I/R injure)研究中，體外建立PC12細胞和原代神經元細胞的OGD/R模型，薯蕷皂苷(200、100和50 ng/mL)預處理12h，用MTT法、LDH、NeuN的釋放測定來評價薯蕷皂苷對OGD/R損傷細胞的保護作用;體內建立SD大鼠MCAO的腦缺血再灌注模型，預防組大鼠隨機分假手術組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給

4、藥組(60、40和20 mg/kg)，每組10只，每天口服給予薯蕷皂苷1次，連續(xù)給藥7天;治療組大鼠隨機分假手術組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給藥組(60、40和20 mg/kg)，每組10只，建立MCAO模型前2h口服給予薯蕷皂苷1次，術后每天給藥一次;以預防組的神經功能缺損評分、大腦TTC染色、大腦相關指數、大腦組織LDH釋放水平、組織病理學、大腦細胞標志物(NeuN、GFAP和Kir4.1)測定和TUNEL檢測，以及治療組的神經功

5、能缺損評分和生存率來評價薯蕷皂苷對MCAO大鼠的腦保護作用;采用westernblotting及Real-time PCR方法考察薯蕷皂苷對大腦中涉及HMGB-1/TLR4炎癥信號通路相關的蛋白和基因表達影響;并采用HMBG-1、TLR4 siRNA干擾和全基因過表達實驗分別驗證薯蕷皂苷是否是通過抑制HMGB-1/TLR4信號通路抗腦缺血再灌注損傷。
　　結果:(1)在抗肝缺血再灌注損傷實驗中，預防組實驗發(fā)現，與模型組相比，薯蕷皂

6、苷能顯著降低血清ALT和AST活性，減輕由肝缺血再灌注損傷導致的肝組織損傷;治療組實驗發(fā)現，與模型組相比，薯蕷皂苷(60 mg/kg)能顯著降低不同時間點血清ALT和AST酶活性，提高大鼠生存率。同時，薯蕷皂苷可顯著降低MDA、iNOS、TNOS、NO含量，升高GSH、GSH-Px、SOD、CAT水平，改善氧化應激，并能夠減少TUNEL陽性細胞數，減輕肝細胞的凋亡;分子機制研究表明薯蕷皂苷能夠降低MAPKs磷酸化水平，下調CYP2E1、

7、IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MIP-1α、MIP-2、NF-κB、AP-1、COX-2和HMGB-1等炎癥因子的基因或蛋白表達水平，降低PARP、Caspase-9、Caspase-3、Bak、p53、Fas和FasL等凋亡蛋白或基因表達水平，上調Bcl-2和Bcl-x的蛋白表達水平。
　　(2)在抗腦缺血再灌注損傷的實驗中，體外實驗發(fā)現，與OGD/R模型組相比，薯蕷皂苷能顯著升高PC12和原代神經元的細胞活力

8、，減少LDH釋放，增加原代神經元的NeuN釋放;體內預防實驗中，與模型組相比，薯蕷皂苷能顯著改善MCAO大鼠的大腦神經功能缺損評分、減少TTC染色陽性區(qū)域、大腦LDH釋放水平、大腦相關指數以及大腦組織的GFAP、Kir4.1和TUNEL陽性細胞數，增加腦組織NeuN陽性細胞數;體內治療實驗中，與模型組相比，薯蕷皂苷可以改善MCAO大鼠的大腦神經功能缺損評分，提高大鼠生存率。分子機制研究表明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷是通過抑制HMGB-1

9、的核轉移，降低HMGB-1蛋白表達水平，從而抑制TLR4炎癥信號通路的相關蛋白NF-κB、AP-1、MAPKs、p-STAT3和炎癥因子;進一步的HMGB-1、TLR4 siRNA和全基因過表達實驗結果證明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷的作用靶點是HMGB-1/TLR4信號通路。
　　結論:(1)薯蕷皂苷是通過調節(jié)氧化應激水平、抗炎和抗凋亡等途徑來實現抗肝缺血再灌注損傷的生物學作用;(2)薯蕷皂苷有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用，這種作