禽J亞群白血病病毒感染細胞外泌體免疫作用研究.pdf

1、禽白血病是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的以禽類造血組織中某些細胞成分過度增生為主的腫瘤性傳染病。ALV是一群具有囊膜的反轉(zhuǎn)錄病毒，除了對禽群的直接危害外，還可引起禽群嚴重的免疫抑制，導致生產(chǎn)力下降，混合感染、繼發(fā)感染頻發(fā)。一直以來，由于ALV病毒群的多樣性、病毒自身的特殊性以及引起疾病的復雜性，國內(nèi)外雖進行了大量的研究，但對免疫抑制的機制仍不是很明確。
　　 外泌體(Exosomes)的

2、發(fā)現(xiàn)，為ALV引起免疫抑制的研究提供了新思路，在ALV與效應細胞間架起了橋梁。著名的“特洛伊木馬假說”認為，逆轉(zhuǎn)錄病毒利用宿主細胞固有的Exosomes形成和釋放途徑，利用Exosomes再攝取的途徑，形成不依賴于包膜蛋白的感染模式作用于其它細胞。Amy等研究發(fā)現(xiàn)在感染人類免疫缺陷病病毒（HumanImmunodeficiency Virus，HIV）的細胞分泌的Exosomes上，檢測到含有HIV的gag蛋白成分。由此，我們推測在AL

3、V感染的細胞分泌的Exosomes上除了gag蛋白外，可能還攜帶ALV的其他蛋白成分，比如囊膜(env)蛋白（含有ALV的免疫抑制區(qū)），攜帶ALV蛋白成分的Exosomes會對遠程細胞產(chǎn)生與ALV相似的免疫抑制作用，即攜帶ALV蛋白成分的Exosomes會在禽白血病早期造成免疫抑制的微環(huán)境，利于ALV在機體內(nèi)的進一步感染與轉(zhuǎn)移。為研究ALV-J感染細胞分泌的Exosomes(Exo-J)含有ALV-J的某些蛋白成分，并在ALV-J造成的

4、免疫抑制中有重要作用，我們將提取的Exo-J蛋白和正常DF-1細胞分泌的外泌體(Exo)變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-blot分析，在26KD左右二者的差異條帶，將條帶切膠后酶解，液相串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，Exo及Exo-J都含有Exosomes的特征性蛋白，如HSP70、丙酮酸激酶、14-3-3與肌動蛋白等，HSP70蛋白家族常作為Exosomes的標志性蛋白。Exo-J含有ALV-J的env和gag蛋白，ALV g

5、ag基因在各亞群間有高度的同源性，gag基因編碼的蛋白主要有27KDa、19KDa、15KDa、12KDa，27KDa即是各亞群均共有抗原的gs群特異性抗原。Env蛋白，即env基因編碼的病毒囊膜糖基化蛋白，包括跨膜糖蛋白亞單位(TM)和膜表面糖蛋白亞單位(SU)。SU含有病毒，受體決定簇，決定亞群特異性和宿主范圍;TM介導病毒與細胞的融合過程。在ALV-J感染細胞分泌的Exosomes中發(fā)現(xiàn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的存在，說明Exo-J在ALV-

6、J感染過程可免疫抑制中發(fā)揮重要作用。
　　 為研究攜帶了病毒成分的Exo-J具有與ALV-J相似的免疫抑制作用，我們設計了Exosomes對脾臟淋巴細胞增殖作用的體外實驗。分離42日齡SPF雞脾臟白細胞，加入一定劑量的Exosomes共培養(yǎng)適當時間后，通過流式細胞儀檢測CD4+、CD8+細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，Exo對淋巴沒有免疫抑制作用，維持在正常水平;低劑量時，Exo-J促進CD4+、CD8+T細胞增殖，但隨著劑量的增加CD4+

7、、CDS+T細胞的數(shù)量降低，這也與實際ALV感染機體細胞的情況類似，感染機體/細胞的病毒越多分泌的Exo-J越多，機體的免疫抑制作用越明顯。為進一步研究Exo-J與ALV-J是否具有免疫抑制協(xié)同作用，設計Exo-J與ALV-J對脾臟淋巴細胞增殖作用的體外實驗。在分離得到的脾臟白細胞中加入Exo-J和ALV-J，結(jié)果顯示，單獨加入Exo-J(20μg)、ALV-J實驗組，CD4+、CD8+數(shù)量明顯低于正常對照組，ALV-J組抑制作用更強，

8、但當兩者共同作用時，其抑制作用沒有增強，反而弱于單一(ALV-J或Exo-J)作用組，與預期結(jié)果完全相反，這種現(xiàn)象可能是由于Exo-J和ALV-J在同一體系中競爭性結(jié)合相同的細胞受體有關，從而導致免疫抑制能力減弱，這種推測還需要進一步的實驗進行驗證。
　　 有研究表明，Env蛋白與細胞表面特異性受體結(jié)合是病毒進入細胞復制。以往的研究也表明，Env蛋白與ALV的免疫抑制密切相關。經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，Exo-J中含有ALV-J的En

9、v蛋白，并在Exosomes對淋巴細胞的作用實驗中，表現(xiàn)出對免疫細胞（系統(tǒng)）的干擾作用，這可能是Exo-J上攜帶的Env蛋白發(fā)揮的作用，Exo-J起到遠程傳遞的作用，其上含有的env蛋白起到作為配體尋找受體的功能，從而為ALV-J的傳播創(chuàng)造相應的微環(huán)境。因此，確定病毒免疫抑制作用的基因區(qū)域，是未來的研究方向。
　　 綜上所述，本研究對DF-1細胞分泌Exosomes的提取方法進行了改進，對Exosomes的物理性狀及生物學活性進