多壁碳納米管和富勒烯碳60對星形膠質細胞功能的差異性影響.pdf

1、當一種材料的組成顆粒的三維尺寸中至少有一維介于0.1～100納米之間時，該材料即可稱為納米材料。納米材料不但具有迥異于宏觀材料的理化性能，還可表現(xiàn)出獨特的生物學效應；納米材料的理化特征是決定其生物學效應的關鍵因素。多壁碳納米管（MWCNTs）和富勒烯碳60（C60）是碳的兩種同素異形體，同時也是具有獨特分子結構、理化和生物學性能的納米材料。MWCNTs和 C60與神經(jīng)組織的相互作用是目前的熱點研究領域，并且這兩種碳基納米材料已表現(xiàn)出在中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的巨大應用潛力。但由于CNS的復雜性，在將MWCNTs和C60安全而有效地引入CNS 之前，尚需開展全面和細致的研究以確保其應用的安全性和有效性。星形膠質細胞是CNS 十分活躍的細胞成分，其在人腦中的數(shù)量十倍于神經(jīng)元，在神經(jīng)系統(tǒng)的結構和生理、病理功能方面發(fā)揮著至關重要的作用。但目前有關納米材料與CNS 相互作用的研究主要集中于神經(jīng)元而較少關注膠質細胞。有鑒于此，本課題對原型MWCNTs和C60與大鼠星形膠質細胞和由人

3、星形膠質細胞轉化而來的膠質瘤細胞的相互作用開展了研究。本課題包括以下三部分內容。
　　 第一部分
　　 細胞活力檢測是任何細胞水平研究的常規(guī)和基礎性工作。噻唑藍（MTT）和刃天青（resazurin）還原法是目前廣為應用的兩種細胞活力檢測法。但我們發(fā)現(xiàn)，MTT和resazurin 法并不能準確反映MWCNTs對細胞活力影響。為能準確檢測MWCNTs的細胞效應，我們建立、驗證了一系列基于流式細胞技術（FCM）的方法，并行之

4、有效地用于研究MWCNTs對星形膠質細胞的效應。作為對照，C60的細胞效應也經(jīng)相同的方法進行了分析。JC-1、DiOC6(3)、R123、FDA和PI是反映細胞不同功能的熒光探針。
　　 我們首先對它們的染色指征進行了表征。結果表明JC-1和DiOC6 (3) 染色是線粒體膜電位 (ΔΨm）的良好指標。ΔΨm是細胞攝取R123的驅動力，但細胞膜轉運蛋白Pgp對細胞內R123的含量有決定性的影響。而另一種細胞膜轉運蛋白MRP 則是

5、細胞FDA 染色的決定因素。隨后分別以上述探針在原位（in situ）和非原位（ex situ）條件下對經(jīng)MWCNTs和C60處理（24h）的細胞進行染色，并FCM 進行分析。結果顯示，在in situ條件下，MWCNTs 顯著降低JC-1和DiOC6(3)的細胞染色但卻增強R123和FDA的染色。而在ex situ 條件下，除FDA 外，MWCNTs對其他探針的染色無顯著影響。與MWCNTs 相比，C60對上述探針的細胞染色無顯著影響

6、，in situ和ex situ 染色結果也無顯著差異。顯微鏡觀察顯示MWCNTs和C60對細胞形態(tài)無明顯影響。上述結果表明：1.探針的染色方式對染色結果有著根本影響提示，2.在本實驗的暴露濃度和時間的條件下，MWCNTs和C60不影響細胞的總體活力，3. 但涉及細胞膜的一些細胞功能可能發(fā)生改變, 4. 熒光探針結合FCM 可方便、有效地反映MWCNTs的細胞效應。
　　 第二部分細胞膜是維持細胞形態(tài)和完成細胞生命功能的重要結構

7、，同時也是細胞與納米材料相互作用的起始界面。跨膜轉運以實現(xiàn)細胞內外的物質交換是細胞膜的一個重要功能。細胞膜轉運蛋白如Pgp和MRP是完成跨膜物質轉運的重要機制。我們在前面的工作中觀察到MWCNTs能提高細胞內羅丹明123(R123)和熒光素(Flu)的含量。R123和Flu分別是Pgp和MRP的特異性轉運底物，因此推測MWCNTs 可能影響細胞膜，尤其是Pgp和MRP 介導的跨膜轉運。在此部分工作中我們即對此假設進行了檢驗：以MWCNT

8、s 處理星形膠質細胞后，分析了細胞對Pgp和MRP 特異性底物的攝取、潴留和外排動力學。Pgp的底物為R123和阿霉素（DOX）；MRP的底物為熒光素（Flu）
　　 和羧基熒光素（CF）；并仍以C60作為對照。結果表明，經(jīng)過MWCNTs 處理后，in situ細胞對DOX的攝取顯著降低，但對其他藥物的攝取無明顯改變；同時MWCNTs 可顯著增加 R123、Flu和CF在in situ細胞內的潴留。動力學分析表明MWCNTs 明

9、顯降低ex situ細胞對R123和Flu的外排速率。與MWCNTs 相比，C60對各底物的細胞攝取、潴留以及外排速率無明顯影響。上述結果提示MWCNTs 可影響跨細胞膜物質轉運，特別是Pgp和MRP 介導的跨膜轉運。
　　 第三部分前面的工作利用大鼠星形膠質細胞模型表明MWCNTs 可抑制細胞膜Pgp和MRP介導的跨膜轉運。Pgp和MRP在人體內有廣泛的分布并有重要的生理和病理意義。尤其值得重視的是，腫瘤細胞過度表達Pgp和M

10、RP是腫瘤多藥耐藥（MDR）現(xiàn)象的重要機制。因此在人腫瘤細胞中研究MWCNTs對Pgp和MRP的影響更具實際意義和價值。鑒于此，此部分工作在MDR人腦膠質瘤細胞中驗證了MWCNTs對Pgp和MRP的效應，并圍繞MRP對MWCNTs的效應進行了初步的機制研究。MRP的轉運功能依賴于還原型谷胱甘肽（GSH）的參與。同時，細胞膜電位也是Flu 外排的重要調控因素。驗證實驗表明，減少細胞內的GSH和改變細胞膜電位均可影響膠質瘤細胞對Flu的外排

11、轉運。我們在經(jīng)MWCNTs 處理的膠質瘤細胞中檢測到大量活性氧（ROS），同時細胞內的GSH水平顯著降低。兩種細胞膜電位探針（DiBAC4(3)和DiOC6(3)）染色分析也顯示MWCNT 可降低細胞膜電位。上述結果提示MWCNTs對MRP的影響機制涉及細胞膜電位改變和氧化應激所致的GSH 減少。
　　 總結1. 研究方法和手段的選擇、驗證和優(yōu)化對于納米材料的生物學效應研究尤為重要。本課題表明流式細胞技術是適用于MWCNTs細胞