結腸腺瘤息肉蛋白N端片段抑制纖毛生長的機制研究.pdf

1、結腸腺瘤息肉蛋白(Adenomatous polyposis coli,APC)是一個腫瘤抑制因子,其突變與家族性結腸腺瘤息肉病(Familial adenomatous polyposis,FAP)的發(fā)生有關。纖毛是突出于細胞表面主要由微管構成的亞細胞結構。纖毛在機體內(nèi)具有重要的生物學功能,可以調(diào)節(jié)細胞運動,參與多種信號通路等。纖毛結構和功能的異常會導致許多纖毛相關疾病的發(fā)生。在FAP中一些表現(xiàn)突出的腸外癥狀,例如纖維瘤、骨瘤、視網(wǎng)膜

2、色素上皮肥大等疾病都是纖毛相關性疾病,這暗示APC突變與纖毛異常之間存在必然聯(lián)系。APC-N是APC中高度保守的一個片段,在許多發(fā)生APC突變的個體中都會保留該片段。本課題主要對APC-N片段影響纖毛生長的機制進行研究,研究內(nèi)容包括以下三部分:
　　第一部分:APC-N片段過表達對MDCK細胞纖毛生長的影響。首先我們將質(zhì)粒pEGFP-C3和重組質(zhì)粒pEGFP-C3-APC-N轉染入MDCK細胞中,繼續(xù)培養(yǎng)3天誘導形成纖毛,west

3、ern印跡和免疫熒光染色結果顯示,APC-N片段在MDCK細胞中成功表達且主要定位在細胞質(zhì)。進一步我們用抗acetylated tubulin鼠單克隆抗體標記細胞內(nèi)的纖毛,免疫熒光染色后觀察并統(tǒng)計細胞纖毛生長率,結果表明,在MDCK細胞中,過表達APC-N明顯抑制纖毛的形成。
　　第二部分:APC-N片段過表達對 pericentrin定位、細胞周期進展及 acetylated tub ulin表達的影響。在第一部分實驗中我們發(fā)現(xiàn)

4、APC-N片段過表達抑制纖毛的形成,本部分將從以下幾方面來探討其抑制纖毛形成的機制:1,APC-N過表達對基體組成蛋白 pericentrin定位的影響;2,APC-N過表達對細胞周期進展的影響;3,APC-N過表達對HDAC6和acetylated tubulin表達的影響。免疫熒光染色和western印跡結果表明,APC-N片段不是通過影響 pericentrin在纖毛基體的定位以及擾亂細胞周期進程來抑制纖毛的形成。但細胞中acet

5、ylated tubulin的水平明顯降低,而HDAC6的表達是上調(diào)的,這表明APC-N通過上調(diào)HDAC6進而降低acetylated tubulin的水平來抑制纖毛的形成。
　　第三部分:APC-N片段通過β-catenin/PI3K/AKT/GSK-3β正反饋環(huán)調(diào)節(jié)對纖毛生長的抑制。為了進一步研究APC-N片段抑制纖毛形成的機制,我們運用western印跡檢測β-catenin和GSK3β的表達,結果顯示,APC-N過表達導致

6、β-catenin表達升高,且GSK3β活性受到抑制。我們分別利用RNA干擾技術和GSK3β抑制劑SB216763敲減β-catenin和抑制GSK3β活性,結果表明,敲減β-catenin導致纖毛生長率提高,而 GSK3β抑制劑 SB216763處理進一步降低了纖毛生長率。這表明β-catenin和GSK-3β參與調(diào)節(jié) APC-N導致的纖毛損傷。為了進一步研究二者之間的潛在調(diào)節(jié)機制,我們檢測了 GSK3β的上游調(diào)節(jié)信號分子 AKT。研

7、究發(fā)現(xiàn) APC-N過表達后, P-AKT(T308)水平升高,這表明 PI3K/AKT信號通路被激活。我們進一步加入PI3K抑制劑和干擾β-catenin來檢測PI3K/AKT信號通路與β-catenin和 GSK3β的關系,結果表明,抑制劑LY294002處理后,β-cate nin和P-GSK-3β(Ser9)的水平降低。同時,纖毛生長率明顯提高;干擾β-catenin后,細胞中 P-AKT(Thr308)的水平降低。這些結果表明一

8、個正反饋環(huán)β-cate nin/PI3K/AK T/GSK-3β調(diào)節(jié)β-catenin和GSK-3β之間的相互作用。此外,為了分析PI3K/AKT信號通路是否直接參與APC-N誘導的纖毛損傷,我們同時用PI3K和GSK3β的抑制劑處理細胞檢測其對細胞纖毛的生長影響,結果表明兩種抑制劑處理只降低了P-AKT(T308)的水平,而并不影響GSK-3β,β-catenin和纖毛生長率。這些結果表明PI3K/AKT信號通路并不直接影響APC-N