南瓜蛋白誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及協(xié)同STI571抗K562細(xì)胞作用的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、藥物治療是惡性腫瘤的三大療法之一。近年來(lái),誘導(dǎo)凋亡和分化療法為腫瘤的藥物治療開辟了新的途徑,也取得了一定成效,但仍缺乏理想的誘導(dǎo)凋亡和分化的藥物。對(duì)天然活性物質(zhì)進(jìn)行抗腫瘤作用的研究,尤其在誘導(dǎo)凋亡和分化方面進(jìn)行探索,將有助于獲得理想的抗腫瘤藥物。 植物來(lái)源的核糖體失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins,RIPs)具有抗生育、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性,其抗腫瘤活性尤其受到關(guān)注。南瓜蛋白(Cucu

2、rmosin)是本課題組從南瓜的瓜瓤中提取的一種新的RIP,本文將對(duì)其體內(nèi)外抗腫瘤活性及抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行研究,旨在為其潛在的抗腫瘤臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、Cucurmosin體內(nèi)外抗腫瘤活性及誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的研究 體外試驗(yàn)(invitro)結(jié)果表明,Cucurmosin對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562和小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16具有較強(qiáng)的殺傷作用,呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。MTT法檢測(cè)表明,陽(yáng)性對(duì)照藥天花

3、粉蛋白(TCS)抑制K562細(xì)胞增殖的ICso值比Cucurmosin大4倍多,提示Cucurmosin對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷作用強(qiáng)于TCS。 體內(nèi)試驗(yàn)(invivo)結(jié)果表明,Cucurmosin對(duì)小鼠B16黑色素瘤和Lewis肺癌移植性實(shí)體瘤具有明顯抑制作用,作用呈劑量依賴性。對(duì)B16黑色素瘤和Lewis肺癌的最大抑瘤率分別為55.2%和65.5%。用藥期間未觀察到明顯的毒性作用,說(shuō)明Cucurmosin具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活

4、性。 以K562細(xì)胞作為研究對(duì)象,觀察Cucurmosin促凋亡作用。形態(tài)學(xué)觀察(AO/EB熒光雙染法、電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察)發(fā)現(xiàn),K562細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃集、核固縮、核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變;DNA瓊脂糖電泳顯示DNA有特征性“梯級(jí)”斷裂:流式細(xì)胞儀DNA倍體分析檢出典型的亞二倍體(sub-G1)凋亡峰。Cucurmosin(2.5ug/m1)作用24h、48h和72h,凋亡率分別為17.2%、35.5%和47.9%

5、,呈明顯的時(shí)間依賴性。上述結(jié)果充分說(shuō)明,Cucurmosin具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用。 二、Cucurmosin誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的探討 K562細(xì)胞是一種人慢性粒細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞株,對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有很強(qiáng)的抵抗性,而抗凋亡機(jī)理主要與其P210bcr/abl蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)活性有關(guān)。通過(guò)抑制bcr/abl融合基因表達(dá)或下調(diào)P210her/au

6、蛋白水平,或拮抗其TK活性,將有效促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡。Westernblot結(jié)果顯示,Cucurmosin顯著下調(diào)K562細(xì)胞P2lobcr/abl蛋白水平,呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性。RT-PCR結(jié)果顯示,Cucurmosin對(duì)K562細(xì)胞bcr/ablmRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。熱休克蛋白90(Hsp90)是P210bcr/abl蛋白的分子伴侶(molecularchaperone),對(duì)P210bcr/abl蛋白具有保護(hù)作用。Weste

7、rnblot結(jié)果顯示,Cucurmosin下調(diào)K562細(xì)胞Hsp90表達(dá),這將促使P210bcr/~U蛋白降解。因此,我們推測(cè)Cucurmosin下調(diào)P210bet/au蛋白水平與其具有核糖體失活活性及下調(diào)Hsp90表達(dá)有關(guān)。 已知促凋亡因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要有兩條:死亡受體激活通路和擾亂線粒體功能通路。我們研究發(fā)現(xiàn),K562細(xì)胞在Cucurmosin作用下線粒體跨膜電位(△ψm)呈時(shí)間依賴性下降,同時(shí)胞漿Cyt-c

8、濃度明顯上升,caspase-3被活化,說(shuō)明Cucurmosin可通過(guò)干擾線粒體功能促使K562細(xì)胞凋亡。在線粒體凋亡通路中,Bcl-2家族起著重要的調(diào)控作用。Westernblot結(jié)果顯示,Cucurmosin下調(diào)K562細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá),同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)。 此外,Westernblot結(jié)果顯示,Cucurmosin下調(diào)c-Myc表達(dá),作用呈時(shí)間依賴性。 三、Cucurmosin與STl571

9、的體外聯(lián)合抗K562細(xì)胞作用 Cucurmosin可下調(diào)K562細(xì)胞P210bcr/abl蛋白水平,STl571對(duì)K562細(xì)胞P210bcr/abl的酪氨酸激酶(TK)活性具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,提示兩藥通過(guò)不同方式對(duì)K562細(xì)胞P210bcr/abl的TK活性將產(chǎn)生雙重抑制作用。因此,我們推測(cè)兩藥具有協(xié)同抗K562細(xì)胞的作用。MTT法顯示,Cucurmosin與STl571合用對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制率大于兩藥相應(yīng)濃度單獨(dú)應(yīng)用的抑

10、制率,大多數(shù)聯(lián)合用藥組合q值>1.15,表明兩藥合用對(duì)K562細(xì)胞體外殺傷有協(xié)同作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明,兩藥具有協(xié)同促K562細(xì)胞凋亡的作用。Westernblot結(jié)果顯示,Cucurmosin和STl571聯(lián)合用藥,對(duì)K562細(xì)胞p210bcr/abl蛋白自身酪氨酸磷酸化的抑制作用比兩藥單用更為顯著,說(shuō)明兩藥對(duì)K562細(xì)胞P210bcr/abl蛋白的TK活性具有雙重抑制作用,這也是它們發(fā)揮協(xié)同作用的主要原因。 綜上所述,Cu

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