Notch3對心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化抑制作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　心肌纖維化(MF)是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變,也是心肌重構的主要表現(xiàn)之一。心肌成纖維細胞(CFs)占心臟間質細胞的90％。在心肌受損后的結構代償中,CFs增殖及分化,分泌膠原,參與組織修復。然而進行性發(fā)展的心肌纖維化將引起心室重構,導致心臟功能障礙。在心肌纖維化過程中,CFs分化為肌成纖維細胞(MFs)是其中一個重要機制。
　　Notch是近年來發(fā)現(xiàn)與細胞組織分化密切相關的信號通路分子。No

2、tch受體有4個亞型(Notchl-4),它們通過與鄰近細胞間的相互作用來精確調控各譜系細胞的分化及各器官的病理生理過程,但其調控機制目前尚不明確。近年來一些研究報道,Notch信號通路參與許多纖維化疾病,然而在心肌纖維化中的研究尚未開展。
　　研究目的:
　　1.CFs向MFs轉化時,Notch3表達量是否發(fā)生變化?
　　2.Notch3表達抑制后,能否促進CFs向MFs轉化?
　　3.Notch3表達上調后,

3、能否抑制CFs向MFs轉化?
　　研究方法:
　　1.用膠原酶和胰酶混合消化法分離培養(yǎng)原代SD仔鼠的CFs,培養(yǎng)24h后,將其分別于含0,1,2,5,10ng/ml5個不同濃度的TGF-β1培養(yǎng)液誘導24h,用Western blot檢測CFs中平滑肌肌動蛋白(α-SMA),用免疫熒光法檢測α-SMA在CFs中的表達,檢測細胞上清羥脯氨酸含量;用Real Time PCR及Western blot檢測Notch3 mRNA及

4、蛋白的表達變化。
　　2.用原代培養(yǎng)的SD仔鼠的CFs,培養(yǎng)24h后,用RNAi法干擾CFs中Notch3的表達,實驗分為3組:即空白對照組,陰性對照組,siRNA干擾組。72h后,用Real Time PCR及Western blot檢測干擾效果,Western blot檢測α-SMA蛋白表達量,用免疫熒光法檢測α-SMA在CFs中的表達情況,檢測各組細胞上清羥脯氨酸含量。
　　3.用原代培養(yǎng)的SD仔鼠的CFs,培養(yǎng)24h

5、后,利用構建的過表達Notch3慢病毒轉染CFs,實驗分為5組:即空白對照組,陰性對照組,Notch3過表達組,TGF-β1誘導組,TGF-β1誘導+Notch3過表達組。72h后,用Real Time PCR及Western blot檢測轉染效果,Western blot檢測α-SMA蛋白表達量,用免疫熒光法檢測α-SMA在CFs中的表達情況,檢測各組細胞上清羥脯氨酸含量。
　　實驗結果:
　　1.采用膠原酶和胰酶混合消化

6、法,成功分離培養(yǎng)SD仔鼠CFs。使用含10%胎牛血清低糖DMEM正常培養(yǎng)24h,用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),可見細胞形態(tài)多樣,為多突的紡錘形或星型的扁平細胞,無自發(fā)搏動,核呈卵圓形、居中。
　　2.正常培養(yǎng)CFs24h,使用無血清低糖DMEM同步化培養(yǎng)24h,再用含0,1,2,5,10ng/ml5個不同濃度的TGF-β1的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。檢測各組CFs細胞細胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達量隨TGF-β1濃度升高而增加,Notc

7、h3 mRNA及蛋白表達量隨TGF-β1濃度升高而降低。其中2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml3個濃度組與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。提示TGF-β1能濃度依賴增加CFs向MFs轉化,同時抑制Notch3表達。
　　3.正常培養(yǎng)CFs24h,使用無血清低糖DMEM同步化培養(yǎng)24h,再使用Notch3的siRNA對CFs進行干擾,與對照組相比,干擾組Notch3 mRNA及蛋白表達下降(P<0.05),同時,干擾

8、組細胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達增加(P<0.05)。提示Notch3表達下調后,CFs向MFs轉化增加。
　　4.利用不同滴度陰性對照病毒對CFs轉染,當復感染指數(shù)(MOI)為20,轉染72h時,熒光顯微鏡觀察轉染效率大約80%左右。因此,本實驗以MOI=20進行病毒轉染。
　　5.正常培養(yǎng)CFs24h,使用無血清低糖DMEM同步化24h,再使用過表達Notch3慢病毒轉染,同時加入10ng/ml TGF-β1誘導1

9、2h組及10ng/mlTGF-β1誘導24h后再轉染Notch3組,與空白對照組相比,過表達組Notch3 mRNA及蛋白表達明顯增加(P<0.05),細胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達減少(P<0.05),TGF-β1誘導組Notch3蛋白表達均下降(P<0.05),細胞上清羥脯氨酸含量及α-SMA表達升高(P<0.05),而與對照組相比,TGF-β1+Notch3組無明顯差異。該結果提示過表達Notch3后,能抑制CFs向MFs轉