非小細胞肺癌中TGFβRI基因異常表達的microRNA調(diào)控機制.pdf

1、目的:本研究旨在探討NSCLC中TGFβRI異常表達的microRNA調(diào)控機制,為NSCLC的早期診斷和治療提供確鑿的實驗依據(jù)。
　　方法:(1)Real-Time PCR和Western Blot方法分別檢測在人正常支氣管細胞HBE和5株NSCLC細胞以及49對NSCLC組織樣本中TGFβRI基因的mRNA和蛋白表達水平。(2)生物信息學軟件預測分析能夠靶向TGFβRI3’UTR區(qū)域的microRNAs,即microRNAs的初

2、步篩選。然后合成microRNAs的模擬體mimics和microRNAs inhibitor mimics,瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞,檢測轉(zhuǎn)染前后TGFβRI mRNA和蛋白表達變化,篩選出可以改變TGFβRI基因表達的microRNAs。并且運用雙熒光素酶活性檢測實驗驗證相關microRNAs是否與TGFβRI3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合,對初步篩選出的microRNAs進一步篩選。(3)qRT-PCR方法檢測在人正常支氣管細胞HB

3、E、5株NSCLC細胞和49對NSCLC組織樣本中最后篩選出的相關microRNAs的表達情況,并將其和TGFβRI的表達作回歸分析,統(tǒng)計出NSCLC中TGFβRI和相關microRNAs表達的相關性。(4)構建最后篩選出的microRNAs的過表達載體和抑制載體,通過慢病毒Lenti-X表達系統(tǒng)篩選獲得可以穩(wěn)定高表達相關microRNA的A549細胞以及能持續(xù)低表達相關microRNA的單克隆A549細胞。并且運用Real-Time

4、PCR和Western Blot技術對篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株進行鑒定,最后獲得轉(zhuǎn)染效率最佳的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,用無血清清的RPMI1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜,然后用TGF-β1刺激A549細胞6 h,最后檢測TGF-β通路主要效應分子pSMAD3的表達。
　　結(jié)果:(1)a、與HBE相比,TGFβR1 mRNA和蛋白在NSCLC細胞株A549、LTEP-a-2、H1299和95C中的表達均是下降的。b、在49例NSCLC組織樣本中T

5、GFβR1 mRNA表達下調(diào)(p<0.05)。c、在24例NSCLC組織中,TGFβR1蛋白表達水平較癌旁組織是下降的(p<0.05)。綜上所述,TGFβR1基因在NSCLC中的表達是下降的。(2)生物信息學軟件預測分析多個microRNAs可以與TGFβR1基因的3’UTR區(qū)域結(jié)合,通過microRNAs模擬體mimics瞬時轉(zhuǎn)染以及Dual Luciferase Reporter Assay實驗驗證,最后篩選出只有miR-142-3

6、p可以影響TGFβR1基因的mRNA和蛋白表達并且這種作用是通過miR-142-3p與TGFβR1基因的3’UTR種子序列直接結(jié)合引起的。(3)與HBE相比,在NSCLC細胞株 A549、LTEP-a-2、H1299和95C中miR-142-3p的表達是上升的。在49例 NSCLC組織樣本中miR-142-3p的表達也是上升的。也就是說,在NSCLC中miR-142-3p是高表達的。將其和TGFβRI的表達作回歸分析發(fā)現(xiàn)NSCLC中兩者

7、的表達之間是負相關的。(4)成功構建穩(wěn)定高表達miR-142-3p的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株和持續(xù)低表達miR-142-3p的單克隆A549細胞株,饑餓培養(yǎng)過夜后用TGF-β1刺激6 h,Western Blot檢測結(jié)果顯示在TGF-β通路里miR-142-3p可以降低pSMAD3的表達。
　　結(jié)論:NSCLC中miR-142-3p能夠直接靶向TGFβR1的3’UTR種子序列。miR-142-3p高表達而TGFβR1基因低表達并且兩者之