sPLA2-IIA對人臍靜脈內皮細胞內皮功能影響的研究.pdf

1、研究背景
　　 動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）疾病是當今國內外發(fā)病率和病死率都較高的疾病之一。作為一種全身彌漫性的病理狀態(tài)，AS是大多數心血管疾病的病理基礎。炎性反應細胞及其釋放的產物已被認為是最主要的促動脈粥樣硬化因素。ⅡA類分泌型磷脂酶A2（secretory phospholipase A2 groupⅡA，sPLA2-ⅡA）作為一個新近研究的重要的炎性反應介質，近年來越來越多的證據表明其在AS的發(fā)生

2、和發(fā)展中也有重要作用。目前關于sPLA2-ⅡA的研究多集中在對巨噬細胞的影響以及與脂代謝的關系上，對內皮細胞的研究較少，還沒有研究說明sPLA2-ⅡA對內皮功能的影響。內皮功能紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要始動環(huán)節(jié)，明確sPLA2-ⅡA的致炎效應是否會影響血管內皮功能，有助于理解sPLA2-ⅡA致動脈粥樣硬化的機制，并有助于采取針對性的措施預防AS的發(fā)生。
　　 研究目的
　　 1.通過測定與分析多種內皮細胞分泌因子的表達

3、水平，包括一氧化氮（nitricoxide，NO）、內皮素-1（endothelin，ET-1）、一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase，eNOS），細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesionmolecule-1，VCAM-1），探索不同濃度的sPLA2-ⅡA刺激對血管內皮功能的影響。
　

4、　 2.通過觀察4-BPB（4-bromophennacyl bromide，sPLA2-ⅡA水解作用的抑制劑）對sPLA2-ⅡA誘導的內皮功能影響的變化，初步探討sPLA2-ⅡA的作用機制，以了解sPLA2-ⅡA的水解作用是否參與了對內皮細胞的誘導作用。
　　 研究方法：
　　 1.體外分離培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）。
　　

5、 2.不同濃度的sPLA2-ⅡA體外刺激HUVEC細胞，設置3個濃度（0.01、0.1、1ug/ml），以未加任何藥物刺激培養(yǎng)的細胞作為空白對照，以10ng/ml TNF-α刺激培養(yǎng)的細胞作為陽性對照，利用試劑盒檢測內皮細胞上清的一氧化氮濃度，并利用熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應（Real-Time PCR）方法分析一氧化氮合酶（eNOS）、內皮素-1（endothelin，ET-1）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）和血管粘附分子-1（

6、VCAM-1）的mRNA表達水平的變化，還利用Western Blot法分析ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表達水平變化。
　　 3.采用體外分離培養(yǎng)HUVEC的方法，以1 ug/ml sPLA2-ⅡA、10nmol/L4-BPB單獨或聯合刺激內皮細胞，利用試劑盒檢測內皮細胞上清的一氧化氮濃度，并通過Real-Time PCR檢測分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1轉錄水平的變化，用Western Blot法

7、分析ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表達變化。
　　 4.用SPSS17.0軟件進行數據統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析（one-wayANOVA），多重比較采用LSD和SNK法。p<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結果：
　　 1.0.1 ug/ml和1 ug/ml的sPLA2-ⅡA均能誘導臍靜脈內皮細胞ICAM-1、VCAM-1mRNA的表達（p<0.01），且誘導作用呈濃度依賴性（p<0.05）

8、：并且sPLA2-ⅡA可上調內皮細胞ICAM-1、VCAM-1蛋白表達水平，呈濃度依賴性。
　　 2.4-BPB干預組細胞的ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表達較1 ug/ml sPLA2-ⅡA單獨刺激組顯著降低（ICAM-1:0.65±0.12 VS0.35±0.08，p<0.01；VCAM-1:0.85±0.14 VS0.60+0.21，p<0.05），4-BPB處理也明顯降低10ng/ml TNF-a誘導的ICAM-

9、1、VCAM-1 mRNA的表達（ICAM-1:0.72±0.03 VS0.47±0.03，p<0.05；VCAM-1:1.24±0.04 vs0.82±0.09，p<0.05）；4-BPB處理降低sPLA2-ⅡA或TNF-a誘導的ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達。
　　 3.0.01ug/ml、0.1ug/ml、1 ug/ml的sPLA2-ⅡA均能誘導臍靜脈內皮細胞ET-1mRNA的表達（p<0.01），并且誘導作用呈濃度

10、依賴性（p<0.05）；1 ug/ml sPLA2-ⅡA能明顯抑制臍靜脈內皮細胞eNOS mRNA的表達（p<0.01），但濃度低于1 ug/ml的sPLA2-ⅡA對內皮細胞eNOS mRNA的表達影響不明顯（p>0.05）；0.1ug/ml和1 ug/ml的sPLA2-ⅡA均能明顯抑制內皮細胞NO的生成（P<0.05，p<0.01）。
　　 4.4-BPB處理明顯減弱1 ug/ml sPLA2-ⅡA調節(jié)的ET-1、eNOS m

11、RNA的表達（ET-1：1.52±0.06 VS1.13±0.06，p<0.01：eNOS：-0.38±0.01 VS-0.15±0.02，p<0.05）；4-BPB處理也明顯減弱10ng/ml TNF-a調節(jié)的ET-1、eNOS mRNA的表達（ET-1:1.89±0.00 VS1.38±0.05，p<0.01；eNOS：-1.52±0.12 VS-0.96±0.04，p<0.01），但是4-BPB處理對sPLA2-ⅡA及TNF-α抑

12、制內皮細胞NO生成的作用不明顯（P>0.05）。
　　 結論：
　　 1.sPLA2-ⅡA能劑量依賴性地誘導內皮細胞ICAM-1、VCAM-1、ET-1的表達，抑制eNOS的表達，減少NO的生成。
　　 2.sPLA2-ⅡA的水解作用是其影響內皮細胞ICAM-1、VCAM-1、ET-1和eNOS表達的機制之一。
　　 3.TNF-α誘導內皮細胞表達ICAM-1、VCAM-1、ET-1、eNOS的過程中可能