重組hTAZ慢病毒表達載體的構建及其對前成骨細胞MC3T3-E1分化的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構建人真核表達的hTAZ慢病毒載體pLenti6/V5-hTAZ，轉染293FT細胞獲得重組慢病毒顆粒，研究hTAZ對前成骨細胞MC3T3-E1分化的調控作用。
　　方法：將已經過測序驗證的，含有hTAZ基因慢病毒入門質粒pENTR221-hTAZ通過LR反應克隆到慢病毒載體pLenti6/V5-DEST中。對重組質粒進行酶切鑒定并在細胞中驗證表達。將該重組載體和慢病毒包裝質粒充分混合，用陽離子脂質體Lipofactamin

2、e轉染293FT細胞，培養(yǎng)和待細胞完全裂解后收集富含hTAZ基因的慢病毒顆粒上清液，取適量上清液感染MC3T3-E1細胞，采用殺稻瘟菌素（Blastcidin）篩選，建立了穩(wěn)定過量表達hTAZ蛋白的MC3T3-E1/hTAZ細胞系。用條件培養(yǎng)基誘導MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ細胞成骨、成脂分化，vonKossa和茜素紅染色比較MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ成骨分化程度差異；油紅O染色比較其成脂分化差異，考察

3、hTAZ基因過表達對前成骨細胞分化的影響。
　　結果：凝膠電泳和測序結果均證明hTAZ重組慢病毒載體pLenti6/V5-hTAZ構建正確，并能在細胞中正確表達。與輔助質粒共轉包裝細胞獲得慢病毒顆粒，并成功感染MC3T3-E1細胞。vonKossa染色和茜素紅染色結果表明，MC3T3-E1/hTAZ細胞成骨分化強于未轉染細胞，而其成脂分化受抑制。
　　結論：本研究構建了人真核表達的質粒載體pLenti6/V5-hTAZ，并能

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