可表達(dá)人呼吸道合胞病毒融合蛋白的輔助病毒依賴型腺病毒載體的構(gòu)建與制備.pdf

1、目的:人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)廣泛流行于世界各地，是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原。目前尚無安全、有效的疫苗用于預(yù)防RSV感染。RSV兩個(gè)重要的糖蛋白膜表面表達(dá)的融合蛋白F(fusion protein，F(xiàn))和粘附蛋白G，是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，也是疫苗研究發(fā)展的重要內(nèi)容。與G蛋白相比，F(xiàn)蛋白有更多的抗原識(shí)別位點(diǎn)，不同亞型間F蛋白高度保守、同源性高達(dá)86％，

2、能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，針對(duì)F的中和抗體具有交叉保護(hù)作用，是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)主要用于基因治療研究，作為疫苗載體的研究起步較晚，尚沒有作為黏膜基因釋放系統(tǒng)用于疫苗研究的報(bào)道。HDAd與腺病毒具有相同的細(xì)胞嗜性，對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞具有高效感染的能力，且能長(zhǎng)期、持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，具有重要的研究與使用價(jià)值。本研究擬

3、構(gòu)建可表達(dá)A亞型RSv F蛋白的輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd/F)，并完成大量制備、純化和F蛋白的體外表達(dá)鑒定，為進(jìn)一步的體內(nèi)免疫效果和免疫保護(hù)作用研究奠定基礎(chǔ)。 方法:將帶有CMV啟動(dòng)子序列的F基因亞克隆至克隆載體pSC11，鑒定正確后，克隆至HDAd質(zhì)粒-pSC15B，構(gòu)建pSC15B/F HDAd重組質(zhì)粒，Pme Ⅰ消化pSC15B/F去除原核復(fù)制元件及抗性基因，獲得 HDAd/F DNA分子，經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染2

4、93Cre4細(xì)胞，16 h后感染輔助病毒，收獲 HDAd/F 載體粗提液，隨后以 HDAd/F粗提液及輔助病毒連續(xù)共感染293Cre4細(xì)胞直至HDAd/F達(dá)到復(fù)制極限，同時(shí)以可表達(dá)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)報(bào)告基因的HDAdLacZ載體作為平行對(duì)照監(jiān)測(cè)載體復(fù)制過程。大量制備 HDAd/F，CsCl密度梯度及等密度梯度兩次超速離心純化，利用分子生物學(xué)技術(shù)體外鑒定HDAd/F表達(dá)情況。 結(jié)果:成功構(gòu)建

5、了可表達(dá) RSV F 蛋白的 HDAd/F 載體，通過與輔助病毒共感染293Cre4細(xì)胞及CsCl梯度法超速離心制備了大量純化的HDAd/F載體，透射電鏡觀察顯示HDAd的直徑約為70 nm，具有典型的腺病毒形態(tài)，運(yùn)用分光光度測(cè)定法分析表明純化后HDAd載體顆粒濃度為：7.4×10<'12>(vp/ml)，體外感染293細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)到F基因有轉(zhuǎn)錄，Western blot分析表明F蛋白有特異性表達(dá)。 結(jié)論:成功構(gòu)建HD