慢病毒介導的RNAi抑制小鼠血管內(nèi)皮細胞α1，3GT表達的研究.pdf

1、目的：應用RNAi(RNAinterference)技術探討靶向α1,3半乳糖基轉移酶(α1,3GT)的shRNA重組慢病毒載體抑制小鼠血管內(nèi)皮細胞α1,3GT和α1,3半乳糖殘基Galα(1,3)Gal表達的可行性。 方法：采用組織植塊法體外培養(yǎng)小鼠血管內(nèi)皮細胞；經(jīng)體外設計合成針對α1,3GTmRNA的序列特異性shRNA,并構建攜帶α1,3GTshRNA的重組慢病毒載體，以慢病毒感染小鼠血管瘤內(nèi)皮細胞系EOMA；熒光實時定量

2、PCR檢測轉染后α1,3GTmRNA表達水平的變化，免疫熒光檢測異種抗原Galα(1,3)Gal表達水平的變化；使用SPSS13.0forWindows進行數(shù)據(jù)分析。 結果：體外組織植塊培養(yǎng)可獲得純度較高的小鼠血管內(nèi)皮細胞；成功構建了重組慢病毒載體質粒。經(jīng)病毒包裝后，得到了攜帶α1,3GT-shRNA的成熟的重組慢病毒顆粒；熒光實時定量PCR檢測顯示構建的重組慢病毒轉染EOMA，能抑制α1,3GT的表達，抑制率約為88％(P<0

3、.01)?？詹《据d體對照組、陰性siRNA對照組與未處理細胞組的mRNA轉錄水平無顯著性差異(P>0.05)；免疫熒光檢測顯示α1,3GT-shRNA重組慢病毒轉染后細胞Galα(1,3)Gal抗原水平較對照組明顯降低(P<0.01)，空病毒載體對照組、陰性siRNA對照組與未處理細胞組間的Galα(1,3)Gal抗原表達無顯著性差異(P>0.05)。 結論：通過組織植塊法可實現(xiàn)小鼠血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)并傳代，但傳代的次數(shù)有限

4、；本實驗成功構建了靶向α1,3GT基因的重組慢病毒載體，并利用該慢病毒載體成功地將α1,3GT-shRNA表達框架轉導入EOMA細胞，使其持續(xù)表達，實現(xiàn)了靶向α1,3GT基因的RNA干擾。重組慢病毒載體有效地抑制了α1,3GTmRNA，并且抑制了其所催化的蛋白Galα(1,3)Gal的表達。通過實驗，初步說明慢病毒載體介導的RNAi技術對沉默α1,3GT基因從而下調異種抗原Galα(1,3)Gal表達的策略是可行的。從而為進一步研究利用