單鏈可變區(qū)片段與趨化因子融合的獨特型淋巴瘤疫苗原核表達質粒的構建及表達.pdf

1、目的： B細胞淋巴瘤細胞表面分泌的膜免疫球蛋白(smIg)是一種明確的腫瘤相關抗原(TAA)，結合免疫佐劑主動免疫接種后可以激活體內免疫系統(tǒng)，靠自身的力量消滅體內殘存的腫瘤細胞，為徹底治愈淋巴瘤提供可能。利用基因工程技術，將膜免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因(VH)和輕鏈可變區(qū)基因(VL)連接的單鏈小分子即scFv，可以模擬完整smIg的抗原性，但免疫原性弱，結合合適的免疫佐劑后，能增強其免疫原性，可以作為瘤苗進行免疫接種。本研究以BA

2、LB/c小鼠源B細胞性淋巴瘤細胞株A20為模型，制備smlg的scFV片段與免疫佐劑趨化因子MCP3融合的獨特型蛋白疫苗，為進一步進行小鼠體內活性試驗奠定基礎。 方法： 重疊延伸拼接PCR技術，通過設計嵌合引物對兩個不同目的序列進行連接。實驗中，先后兩次應用重疊延伸拼接PCR技術，制備小鼠B細胞性淋巴瘤細胞表面的獨特型膜免疫球蛋白的scFv基因片段及scFv和。MCP3融合基因片段。按重疊延伸PCR反應原理，設計6對引物

3、，將Ig VH和Ig VLcDNA用一段編碼(Gly<,4>Ser)<,3>連接肽的基因序列連接，然后，將scFv片段與免疫佐劑MCP3基因序列通過一段編碼NDAQAPKS的spacer序列連接起來。其中，spacer序列可以保證scFv和MCP3蛋白正確折疊并保持各自獨立的生物學活性。獲得的scFv-MCP3融合基因片段經Sac I、Kpn I雙酶切、定向克隆到原核表達質粒pGLo,再次酶切鑒定及測定核酸序列準確無誤后轉化到大腸桿菌中

4、表達融合蛋白。 1、培養(yǎng)A20細胞，提取細胞內總RNA：B細胞性淋巴瘤細胞株A20培養(yǎng)于高糖．DMEM培養(yǎng)基中，收獲對數生長期的細胞，用Trizol試劑盒提取細胞內總RNA，瓊脂糖電泳鑒定RNA的質量，分光光度計定量。 2、RT-PCR．法擴增IgVH、IgVL cDNA片段：以抽提的A20細胞內的總RNA為模板，六核隨機引物法進行反轉錄。再以反轉錄產物為模板，分別以VHo5’和VHo3’、VLo5’和VLo3’為引物

5、，擴增IgVH、IgVL cDNA片段。擴增產物電泳鑒定后進行核酸測序。 3、重疊延伸PCR法制備scFv基因片段：反應分兩步進行：第一步，以IgVH、IgVL cDNA片段為模板，分別用特異性引物VH 5’和VH 3’、VL 5’和VL 3’對IgVH、IgVL cDNA片段進行修飾擴增，使IgVH cDNA下游末端與IgVLcDNA上游起始端出現互補結合區(qū)；第二步，等摩爾數的IgVH、IgVLcDNA修飾擴增片段為模板，加

6、入同一反應體系中，變性后雙鏈DNA解鏈，發(fā)生退火時，少量的互補末端的模板互補結合，互為模板并提供羥基末端，反向延伸，制備scFv片段。數個循環(huán)后加入引物VH 5’和VL 3’，按相同的PCR參數循環(huán)，得到一定量的IgVH cDNA和IgVL cDNA連接片段即scFv片段。 4、MCP3基因的擴增：以含有MCP3基因序列的質粒為模板，用設計引物MCP3 5’和MCP3 3’擴增MCP3基因。 5、重疊延伸PCR法制備

7、scFv與MCP3的融合基因片段：與制備scFv片段過程第二步相同：以等摩爾數的scFv基因片段和MCP3修飾片段為模板，以VH 5’和MCP3 3’為引物，連接制備scFv-MCP3融合基因片段。 6、scFv-MCP3融合基因片段克隆質粒的構建：scFv-MCP3融合基因片段與pGEM-T載體連接，操作按說明書，用連接產物轉化感受態(tài)細菌DH5 α，涂到LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色克隆，放

8、大培養(yǎng)，提取質粒，進行PCR及Sac I、Kpn I雙酶切鑒定陽性克隆，送大連寶生物公司測序。 7、scFv-MCP3融合基因片段原核表達質粒的構建：經測序證實的陽性重組質粒經Sac I、Kpn I雙酶切后，回收目的基因片段，然后經T4連接酶與同樣處理的表達質粒載體pGLo進行連接，轉化感受態(tài)細菌DH5α，涂布于LB/氨芐平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑選數個菌落放大培養(yǎng)，抽提質粒。酶切及PCR鑒定陽性克隆。 8、scFv-

9、MCP3融合蛋白疫苗的表達：含有重組原核表達質粒的單克隆DH5 α菌培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，當菌液.A<,600nm>=0.6左右時加入0.01％阿拉伯糖(L-arabinose)30℃低溫誘導4小時，誘導前后菌體制樣，10％SDS-PAGE凝膠電泳檢測。 結果： 1、基因片段的擴增及測序鑒定：RT-PCR擴增IgVH、IKVL cDNA的產物與預期大小一致，約400bp左右。測序結果顯示IgVH、IgVL cDNA序列與

10、文獻報道一致，IgVH、IgVL基因序列翻譯成氨基酸序列后與文獻報道序列基本一致。測序后的IgVH、IgVL cDNA經相應的引物修飾后長度分別為407bp、401bp。以含MCP3基因的質粒為模板擴增MCP3基因，產物大小為335bp。經重疊延伸PCR獲得scFv片段，產物為793bp，擴增scFv-MCP3融合基因片段，產物大小1111bp，與pGEM載體連接后挑選陽性的克隆測序，結果表明scFv和MCP3連接正確，并且無移碼突變發(fā)

11、生。在融合基因的制備擴增過程中，在IgVL序列內第231位核苷酸發(fā)生A→G堿基突變，其所在的讀碼框由ACA變?yōu)锳CG，但均編碼Thr，為無義突變，不影響蛋白表達后的氨基酸序列，未予修正。 2、重組表達質粒的酶切鑒定：重組表達質粒pGLo/scFv.MCP3被Sac I和Kpn I雙酶切為約1100bp和5400bp兩條片段。酶切結果表明成功構建表達質粒pGLo/scFv-MCP3。 3、融合蛋白質的表達：含重組表達質

12、粒pGLo/scFv-MCP3的大腸桿菌DH5a培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，阿拉伯糖30℃誘導4小時后可高效表達融合蛋白GFP-scFv-MCP3，SDS-PAGE電泳分析證實融合蛋白的表達量占菌體蛋白30％，融合蛋白的大小為65kD。與預期結果相符。 結論： 1、成功構建鼠源scFv片段與趨化因子MCP3融合的獨特型B細胞淋巴瘤疫苗表達質粒pGLo/scFv.MCP3，并實現融合蛋白的初步表達。為融合蛋白疫苗體內活性檢測準備實

13、驗基礎。 2、重疊延伸拼接PCR過程中堿基與模板的錯配率要明顯高于常規(guī)PCR反應，即使使用保真性較好的聚合酶也不能避免錯配的發(fā)生，可能導致堿基序列的點突變。測序結果驗證序列拼接準確無誤并且無移碼突變后進行下一步實驗。因此一定要使用保真性更高的DNA聚合酶，盡量避免點突變的發(fā)生。 3、可以對經典重疊延伸PCR技術的步驟進行簡化，將等摩爾數的模板、引物同時加入反應體系中進行PCR擴增，就可以得到一定豐度的特異性擴增產物。