小鼠附睪特異蛋白LCN6的轉錄調控和多克隆抗體的制備.pdf

1、附睪是精子成熟和儲存的重要場所，精子在穿越附睪的過程中與不斷變化的附睪微環(huán)境相互作用而逐漸成熟，獲得運動和受精的能力，而附睪特殊的微環(huán)境變化歸因于附睪基因的表達和調控的結果.本課題研究的mLCN6(mouse lipocalin6)是我們實驗室根據(jù)大鼠LCN6基因首次從小鼠附睪中克隆得到的同源基因，在附睪頭部特異表達，經(jīng)序列和二級結構預測表明該基因屬于lipocalin家族。本課題將深入研究mLCN6的基因特性，我們以往的研究表明，mL

2、CN6通過變異剪切產(chǎn)生兩個主要轉錄本，分別命名為mLCN6α和mLCN6β；原位雜交結果表明該基因在附睪起始段及近端頭部特異表達；發(fā)育性變化表明該基因在出生后3周開始出現(xiàn)，并且在性活躍期和成年期間保持較高水平，老年以后隨時間逐步下降，說明該基因可能受雄激素調控并且與精子的成熟和生殖水平密切相關。
　　 本論文的第一部分研究工作旨在探討小鼠附睪上皮細胞中的mLCN6 mRNA表達的調控。我們用Northern Blot的方法對閹割

3、后及雄激素注射后小鼠附睪中mLCN6mRNA的表達進行分析，結果表明：mLCN6 mRNA在小鼠附睪中的表達與血清中睪酮的濃度呈正相關。閹割后mLCN6 mRNA表達迅速下降，皮下注射睪酮后，mLCN6mRNA的表達先升后降，但并沒有恢復到閹割前水平。輸出小管結扎以后阻止了睪丸中的流體進入附睪但并不影響雄激素的分泌，Northern Blot結果發(fā)現(xiàn)結扎側附睪mLCN6 mRNA表達水平顯著低于對照側，通過時間的變化還發(fā)現(xiàn)結扎后第一天結

4、扎側附睪mLCN6 mRNA表達水平就已經(jīng)顯著下調，并隨時間推移始終保持較低水平。RT-PCR結果表明mLCN6α和mLCN6β受雄激素和睪丸因子影響是相同的。以上實驗結果提示mLCN6基因在附睪中受雄激素和睪丸因子共同調控。
　　 為了從蛋白質水平深入研究mLCN6α和mLCN6β在精子成熟中的作用以及這兩個isoform在蛋白水平上的表達差異，需要制備特異性抗體。因此，我們在大腸桿菌中分別表達了mLCN6α和mLCN6β共有

5、的一條含118個氨基酸的肽段和將mLCN6α特有的58個氨基酸雙拷貝串聯(lián)起來的肽段，分別命名為mLCN6C和mLCN6D；通過SDS-PAGE凝膠蛋白電泳及電洗脫純化這兩個目的蛋白，并將純化的目的蛋白分別免疫新西蘭大白兔，得到了兩種抗血清；經(jīng)ELISA和Western印跡檢測證明得到了兩種效價比較高、特異性比較好，并且能夠分別特異性結合mLCN6C和mLCN6D融合蛋白的抗血清，為進一步探索mLCN6的功能提供了重要的基礎。