突變型PUMA對Hela細胞生物學功能的影響及其分子機制.pdf

1、p53上調凋亡調制物(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是一個具有強大促凋亡能力的BH3-only家族蛋白質基因。PUMA通常低表達，但PUMA在許多病理性應激因素可以通過一些轉錄因子(如p53、p73、E2F1和FOXO3a)上調其表達，借此誘導凋亡的反應。近兩年研究發(fā)現一個新穎的調控機制:PUMA翻譯后調控。轉錄體PUMA-α編碼一個全長為193個氨基酸的蛋白，其中10號位絲氨酸

2、是最重要的磷酸化位點。當10號位絲氨酸被丙氨酸取代可以減慢PUMA的降解、延長其半衰期、增加其穩(wěn)定性、增強細胞凋亡的能力。
　　本課題旨在探討針對PUMA蛋白10號位磷酸化位點突變的突變型與野生型PUMA蛋白對腫瘤細胞功能方面的差異及其可能的作用機制，為以后尋找更多PUMA蛋白翻譯后調控機制梁奠定實驗基礎。
　　目的:
　　觀察突變型PUMA與野生型PUMA對腫瘤細胞生物學功能方面的差異，并探討其誘導細胞凋亡的分子機制

3、，此為深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻譯后調節(jié)奠定實驗基礎。
　　方法:
　　通過PCR方法從pCEP4-(HA)2-PUMA質粒中擴增PUMA基因，并克隆到pIRES2-EGFP載體上，構建PUMA真核表達載體pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA，利用定點突變技術構建pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA-T28G質粒，行PCR及測序鑒定;脂質體分別將兩種質粒轉染Hela細胞，RT-PCR檢測PUMA的表

4、達，Western blot檢測突變型PUMA蛋白和標簽蛋白的表達。
　　實驗隨機分為(1)空載質粒組(2)野生型PUMA組(3)突變型PUMA組，應用脂質體轉染的方法分別將空載質粒、野生型PUMA質粒、突變型PUMA質粒轉染人宮頸癌細胞中，轉染24h及48h后用RT-PCR和Western blot方法檢測各組PUMA表達情況;MTT及流式細胞術檢測野生型PUMA與突變型PUMA對細胞增殖抑制和促凋亡作用;應用PI及Hoechs

5、t33342核染法觀察野生型PUMA與突變型PUMA對細胞凋亡的形態(tài)學改變;野生型實驗組和突變型實驗組分別加入蛋白質合成抑制劑放線菌酮后，Western blot方法檢測PUMA蛋白的表達變化情況;RT-PCR方法檢測PUMA及凋亡相關基因BAX、BCL-2的mRNA的表達變化;分光光度法檢測細胞的Caspase-3活性變化。
　　結果:
　　經PCR及測序結果表明，正確構建野生型、突變型PUMA重組質粒，PUMA基因第10

6、位氨基酸的第28～30位堿基由TCC突變?yōu)镚CC，其他堿基均無突變。野生型、突變型PUMA重組質粒轉染Hela細胞熒光顯微鏡觀察到綠色熒光表達。Western blot和RT-PCR均檢測出目的基因的高表達。提示PUMA基因及其定點突變載體均構建成功。
　　在相同轉染效率的情況下，通過Western blot分析野生型PUMA組和突變型PUMA組的表達水平，結果表明突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一個更高的穩(wěn)定狀態(tài)。在表達

7、野生型和突變的PUMA細胞中我們通過實時定量PCR測量出同等量的PUMA mRNA，表明并不是由于轉染效率或不同的轉錄率導致的這種差異;接下來在轉染24h后誘導表達野生型和突變型的PUMA細胞中均加入蛋白質合成抑制劑放線菌酮，然后對PUMA蛋白的降解進行檢測，結果表明，由于我們改變了PUMA蛋白的磷酸化位點，導致突變型PUMA蛋白降解延遲、半衰期延長，提示10號位絲氨酸磷酸化在決定PUMA降解率上具有重要的作用;野生型PUMA質粒、突變

8、型PUMA質粒分別轉染Hela細胞，在24、48小時后測定光密度值，結果發(fā)現細胞轉染兩種質粒后，細胞存活率隨著時間的延長逐漸下降，且轉染突變型PUMA質粒在24、48小時的存活率均比野生型PUMA質粒組低，差異有統計學意義(P＜0.05)，這表明突變型PUMA對Hela細胞抑制增殖作用優(yōu)于野生型PUMA;通過PI及Hoechst33342染色后評價細胞核型，計算被轉染細胞中的早期和晚期凋亡細胞數。轉染24h后，轉染突變型PUMA組在GF

9、P陽性細胞中有22.5％的細胞出現凋亡，空載體組只有11.8％，相比轉染野生型PUMA組細胞中增加了約9.2％的細胞凋亡，差異有統計學意義(P＜0.05)。而隨著轉染PUMA在細胞中表達時間的延長，48h后突變型PUMA組比轉染野生型PUMA組細胞凋亡增加了約9.5％，差異有統計學意義(P＜0.05)。流式細胞術結果發(fā)現，隨著PUMA轉染時間的增加，野生型和突變型兩組腫瘤細胞的凋亡率均逐漸升高，并且突變型組細胞比野生型組細胞的凋亡率增加

10、更加明顯，這與核染色結果相似。
　　轉染突變型PUMA質粒作用Hela細胞，在0、6、12、24、36、48小時，通過RT-PCR法檢測BCL-2和BAX表達。結果發(fā)現，隨著時間的延長，在PUMA表達逐漸增加的同時，BCL-2表達逐漸減少，而BAX表達無明顯變化。PUMA表達在48小時達到最高點，而BCL-2表達在48小時降低到最低點，不同時間點的PUMA和BCL-2表達差異有統計學意義(P＜0.05).提示PUMA轉染細胞后降低

11、了BCL-2的活性，而PUMA對細胞內BAX總量沒有明顯影響(P=0.060)。檢測Caspase-3各個時間組活性變化結果表明，在轉染突變型PUMA作用后，Caspase-3活性顯著升高，轉染6h組是0h組的(1.23±0.23)倍，轉染12h組是0h組的(2.05±0.17)倍，轉染24h組是0h組的(2.75±0.22)倍，轉染36h組是0h組的(3.32±0.24)倍，48h達到最高程度，是0h組的(4.21±0.21)倍，各組

12、與0h組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、PUMA具有抑制Hela腫瘤細胞增殖、促進其凋亡的作用，并且突變型比野生型PUMA對Hela腫瘤細胞的抑制作用及促凋亡功能更加明顯。
　　2、PUMA10號位點的絲氨酸是重要的磷酸化位點，絲氨酸被丙氨酸取代后增加了PUMA穩(wěn)定性，減慢了其降解、延長了其半衰期。
　　3、PUMA對Hela腫瘤細胞的促凋亡作用，是通過調控抗凋亡BCL-2表達，最終導