非編碼小RNA(RyhB)調控禽致病性大腸桿菌生物學表型分析及靶蛋白的篩選.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)是一種能引起家禽局部或全身性傳染病的細菌，能與很多病毒性疾病和其他細菌性疾病并發(fā)。隨著世界集約化養(yǎng)雞行業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率也逐步升高，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展造成了巨大的損失。在大腸桿菌研究中，人們提出了一種新的基因調節(jié)子，即為非編碼小RNA(small non-coding regulatory RNA，sRNA)，其在轉錄后可調節(jié)基

2、因的表達水平，主要參與的調節(jié)途徑包括轉錄翻譯調控、鐵代謝途徑、糖代謝途徑、膜蛋白生物合成、群體感應系統(tǒng)以及致病菌的致病力調節(jié)等。而RyhB也是小RNA的一種，在細菌致病調控網絡中起到關鍵作用。此外，RyhB除了參與調節(jié)鐵代謝外，在霍亂弧菌和痢疾志賀氏菌中，還發(fā)現RyhB的還能調控細菌動力、化學趨化、生物膜、酸性耐受力、氧化還原甚至毒力基因的表達等。因此，研究RyhB與APEC致病性之間的聯(lián)系，為防控大腸桿菌病提出實驗依據。
　　本

3、研究以實驗室RyhB缺失株為基礎，研究RyhB缺失條件下對細菌的生物學特性的影響，并利用蛋白質組學技術比較野生株與缺失株差異表達的蛋白，篩選出影響APEC毒力等相關特性的相關靶基因，進一步揭示了RyhB與APEC致病力之間的關系。具體研究內容和結果如下:
　　1、sRNA-RyhB對禽致病性大腸桿菌生物學特性影響
　　本實驗分別從生長曲線實驗、組織載菌量實驗、菌體超顯微結構觀察實驗、生物被膜形成能力檢測實驗、LPS完整性實驗

4、、環(huán)境耐受力檢測實驗等來研究禽致病性大腸桿菌RyhB對細菌的生物學特性影響。生長曲線實驗結果表明，RyhB沒有影響其生長性能;組織載菌量實驗表明，注入△RyhB肝臟組織載菌量相比野生株的肝臟組織載菌量降低了6.91倍;超顯微結構觀察實驗表明，同樣的生長條件下，親本菌AE17有完整的菌毛，而缺失株則沒有完整菌毛;生物膜試驗結果表明，RyhB基因缺失后，生物膜的形成能力減弱，回復株有所回復，但并沒有回到野生株生物膜形成能力;LPS完整性實驗

5、結果表明RyhB缺失沒有影響有LPS的完整性;環(huán)境耐受力實驗表明，缺失株△RyhB對氧化不敏感，熱應激增強，耐酸性增強，耐堿性減弱。
　　2、sRNA-RyhB調控禽致病性大腸桿菌靶蛋白的篩選
　　為探索RyhB可能調控的毒力基因。應用蛋白質組學技術，從蛋白水平比較野生株和缺失株之間差異蛋白表達情況。結果顯示，與野生株相比，共發(fā)現62個差異蛋白。其中Omsc、Galu、Nlpe、Tata、GmhA、proX、inFA、cys

6、E可能是RyhB直接調控的毒力相關基因。通過GO(Gene Ontology)分類結果顯示，差異表達蛋白參與的細胞組分包括細胞膜、胞外區(qū)、細胞器、核質組成等;分子功能主要表現抗氧化功能、蛋白結合、催化活性、分子功能調節(jié)、信號傳導、轉運蛋白功能等;參與的生物學過程主要包括調控生物調節(jié)、運動過程、新陳代謝過程、多細胞生物學過程、應激反應、單一生物體調節(jié)過程等。通過實時熒光定量PCR技術檢測其中10個差異蛋白基因的轉錄水平，結果與蛋白質組學一

7、致。
　　3、sRNA-RyhB調控禽致病性大腸桿菌酸性耐受力以及影響生物膜形成靶蛋白分析
　　本實驗基于蛋白質組學技術，篩選得到與酸性耐受力有關的蛋白，并通過實時熒光定量PCR技術對篩選的差異蛋白基因的轉錄水平進行檢測，其結果與蛋白質組學結果一致。在篩選出的差異蛋白的基礎上，結合在線預測軟件篩選可能直接作用的與生物膜形成有關的靶蛋白。實驗成功構建了pET28a-cysE表達載體，獲得可溶性cysE蛋白，用Western B

8、lot檢測重組質粒表達產物，在蛋白大小約36kDa處有一條蛋白帶，表明表達產物有良好的特異性。
　　以上研究結果表明，RyhB的缺失能影響禽致病性大腸桿菌菌毛的表達并降低肝臟的載菌量、降低生物膜的形成、增強熱應激、增強耐酸性、減弱耐堿性。表明RyhB在調控APEC毒力作用中扮演重要角色，并結合蛋白質組學技術篩選出與生物膜形成、酸性耐受力有關的蛋白。為后續(xù)研究RyhB調控靶點奠定了一些基礎，同時也為進一步研究APEC的致病作用及宿主