水稻瘤矮病毒P3與Pns9互作研究.pdf

1、水稻瘤矮病是我國華南地區(qū)發(fā)生較為普遍的病害之一，該病由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)引起。RGDV的基因組全序列已測定，對各基因片段所編碼的蛋白功能亦有所了解，但有關RGDV各基因之間的互作機制及其與寄主水稻的互作的尚不清楚。RGDV基因組由12個dsRNA片段組成，除S9片編碼2個蛋白外，其他片段均編碼單一蛋白。本文應用酵母雙雜交技術和雙分子熒光互補技術研究水稻瘤矮病病毒結構蛋白P3與非結構蛋白

2、Pns9之間互作關系及互作區(qū)域；以RGDV S3編碼的基因片段P3為誘餌，篩選水稻cDNA文庫，獲得了與P3互作的一種水稻蛋白，即含天冬氨酸蛋白酶結構域的蛋白(eukaryoticaspartyl protease domain containing protein, ASP)。
　　 為了驗證RGDV的P3與Pns9之間的互作，提取水稻幼嫩葉片總RNA，通過RT-PCR擴增，而獲得水稻瘤矮病毒基因S3和S9全長序列，將其連接到

3、pGADT7、pGBKT7酵母雙雜交載體，構建成重組子pGAD-S9、pGAD-S3和pGBK-S3、pGBK-S9。將誘餌重組質粒pGAD-S3、pGBK- S3和pGAD-S9、pGBK-S9重組質粒分別共轉化酵母菌AH109中，涂布不同營養(yǎng)缺陷型選擇性培養(yǎng)基平板上，顯示RGDV P3與Pns9的互作情況。結果表明，S3基因編碼的P3蛋白能和S9基因編碼的Pns9發(fā)生互作。以構建好的酵母表達載體pGBK-S3、pGBK-S9為模板，

4、分別擴增獲得融合YGFP基因的水稻瘤矮病毒S3和S9基因，并插入Bifc載體pSPYNE-35S， pSPYCE-35S，構建成重組載體pSPYNE-S3、pSPYCE-S3、pSPYNE-S9、pSPYCE-S9，然后將重組Bifc載體重組子分別轉化農桿菌后，注射煙草，觀察煙草中瞬時表達情況，確定蛋白的互作情況。雙分子熒光互補檢測得到的結果與酵母雙雜交實驗結果一致，蛋白P3與Pns9存在互作作用。在病毒粒子中P3內層衣殼蛋白能夠與非結

5、構蛋白Pns9互作。本文還在RGDV P3與Pns9之間互作的基礎上，將S3和S9基因分通過PCR擴增獲得水稻瘤矮病毒基因S3的三個突變體和S9三個突變體，S3所編碼蛋白P3的N1端缺少60bp、N2端缺少120bp、 N3端缺少180bp， S9所編碼蛋白Pns9的N1端缺少150bp、N2端缺少300bp、N3端缺少510bp，用酵母雙雜交技術進一步確定其互作的活性部位。實驗表明，P3的N端第20個氨基酸至40個氨基酸與Pns9的N

6、端第1個氨基酸至50個氨基酸所編碼蛋白為兩者互作的區(qū)域。
　　 最后，用酵母雙雜交技術用蛋白P3篩選水稻cDNA文庫，篩選出ASP蛋白，進一步用雙分子熒光互補技術驗證P3蛋白與ASP蛋白之間的作用，其結果為不互作，P3蛋白與水稻ASP蛋白的互作情況有待進一步使用其它方法驗證。
　　 綜上所述，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術技術確定RGDV功能蛋白P3和非結構蛋白Pns9存在互作，并確定RGDV P3蛋白N端第20個氨