抗異硫氰酸熒光素單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）是目前應用最廣泛的熒光素，因其特殊的分子結構及理化性質，F(xiàn)ITC常用作熒光標記物對蛋白質、核酸、多糖等生物大分子進行標記。尤其是基于FITC建立的FITC-抗FITC檢測系統(tǒng)，能夠有效地擴大抗原抗體反應的敏感性。本實驗采用直接標記法制備出異硫氰酸熒光素人工完全抗原，并通過雜交瘤技術研制出高親和力、高特異性的雜交瘤細胞株，利用體內誘生腹水技術制備出抗異硫氰酸熒

2、光素單克隆抗體，并對其免疫學特性進行了鑒定。抗 FITC單克隆抗體的研制為高效、快速地對FITC標記的蛋白質、核酸、多糖等生物大分子進行檢測奠定了基礎。
　　1.異硫氰酸熒光素人工完全抗原的合成及鑒定
　　采用直接標記的方法將 FITC分別與大分子偶聯(lián)載體牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）進行偶聯(lián)，合成人工完全抗原 FITC-BSA和 FITC-OVA。通

3、過紫外吸收光譜法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和動物免疫法對人工完全抗原的偶聯(lián)效果進行鑒定。依照紫外吸收光譜結果計算出 FITC-BSA和 FITC-OVA的偶聯(lián)比分別為14:1和13:1；SDS-PAGE鑒定結果顯示：FITC-BSA和 FITC-OVA的條帶相對于載體蛋白 BSA和 OVA的條帶出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象，初步證明偶聯(lián)成功。動物免疫實驗結果顯示：制備的 FITC-BSA能夠誘導小鼠產生有效免疫應答，多抗血

4、清效價均可達到1:12800，其中3號小鼠的半數(shù)抑制濃度 IC50可以達到4.25 ng/mL，表明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。
　　2.異硫氰酸熒光素單克隆抗體的制備及鑒定
　　選取免疫效果最好的3號小鼠進行細胞融合，通過間接ELISA法和間接競爭 ELISA法篩選出兩株強陽性雜交瘤細胞株，分別將其命名為1F11和2A7，采用有限稀釋法分別對其進行亞克隆，三輪亞克隆后篩選出細胞培養(yǎng)上清效價較高（1:3200）的2A7

5、雜交瘤細胞株，通過小鼠體內誘生腹水的方法大量制備抗 FITC單克隆抗體，通過正辛酸-硫酸銨法對收集到的單抗腹水進行純化， SDS-PAGE電泳結果顯示其僅在53 KD和25 KD處存在兩條明顯的特異性條帶，表明純度較高。經(jīng)鑒定，純化后的2A7單抗效價可以達到1:2.048×106，親和力常數(shù)為1.72×109 L/mol，對FITC的IC50為1.37μg/mL；根據(jù)鼠單抗亞型鑒定試劑盒測定其亞型為 IgG1、κ輕鏈型；特異性鑒定結果顯