惡臭假單胞菌海藻糖合酶基因在大腸桿菌中的表達.pdf

1、海藻糖具有非常重要生物學意義的,對生物大分子起到一定的保護作用,可以保護生物免受干燥、高溫、低溫、輻射、高滲等惡劣環(huán)境的傷害,因此具有巨大的市場前景和應用價值。海藻糖的研究興起于日本,后在各國掀起了研究熱潮。近年來國內(nèi)對海藻糖的研究,主要集中在酵母的抽提和微生物發(fā)酵領域,但在分子生物學領域才剛剛起步。隨著越來越多的海藻糖合酶基因公布于眾,海藻糖在分子生物學領域的研究越來越熱。
　　本課題正是使用基因工程手段,通過對惡臭假單胞菌海藻

2、糖合酶目標基因的克隆和外源載體的高效表達獲得大量目的蛋白,擺脫了代謝調(diào)控機制對海藻糖合酶基因的控制,得到穩(wěn)定的重組菌,使酶量得到顯著提高,酶活相對增加,為利用該酶轉化麥芽糖生成海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定研究基礎。
　　本研究以惡臭假單胞菌P06基因組DNA為模板,通過PCR技術、雙酶切、連接載體、導入大腸桿菌BL21(ED3),成功克隆了P06菌株的海藻糖合酶基因。通過測序?qū)06海藻糖合酶基因進行了分析,并構建了P06海藻糖合酶的系

3、統(tǒng)進化樹,說明惡臭假單胞菌的海藻糖合酶基因具有一定的同源性和保守性。對重組菌進行IPTG誘導,成功表達目的蛋白。對基因工程菌進行酶活測定,表明每毫升粗酶液酶活達到11.84U/mL,每克干菌體的酶活達到297.6U/g,比原始菌株P06有較大提高。對重組菌的遺傳穩(wěn)定性進行了測試,六次傳代后質(zhì)粒丟失率為20％,說明構建的基因工程菌可穩(wěn)定傳代。
　　對實驗室搖瓶發(fā)酵時的誘導條件進行了優(yōu)化,然后在此基礎上對影響酶活的關鍵參數(shù)進行優(yōu)化。最

4、終確定:誘導溫度為25℃,誘導劑添加量為0.6mmol/L,誘導時機為培養(yǎng)至OD600=0.8時開始誘導,誘導時間為6h;粗酶液反應體系中最適pH為7.5,反應溫度35℃、體系反應2h、底物濃度為30％。在優(yōu)化后的最有條件下,對樣品海藻糖含量進行高效液相色譜檢測。每毫升粗酶液酶活力為318.12U/mL。
　　通過對5L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)條件的探索,采用流加葡萄糖和氮源的方式可以大大延長對數(shù)期并且增加菌體收得率,發(fā)酵總時長21h,保