微生物脂肪酶庫(kù)構(gòu)建及磷脂酶D的篩選與應(yīng)用.pdf

1、脂肪酶作為工業(yè)大宗酶之一，能夠催化水解、酯合、酯交換、醇解、酸解、氨解等反應(yīng)，被廣泛地用于食品、醫(yī)藥、紡織、飼料、洗滌、造紙、生物柴油及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。微生物脂肪酶相比于動(dòng)植物 來(lái)源脂肪酶具有來(lái)源廣泛、易于制備、底物特異性較強(qiáng)、催化效率較高、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物較少等優(yōu)點(diǎn)。伴隨著脂肪酶應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，對(duì)其特異性的要求也逐漸提高，從自然界中篩選特異性脂肪酶菌株是一個(gè)較為簡(jiǎn)便可行的方法。
　　利用維多利亞藍(lán)和皂化鈣圈的方法我們從19份

2、內(nèi)陸土壤樣品和22份南海深海沉積物樣品中平板初篩獲得538株產(chǎn)酶菌株。復(fù)篩我們采用特異性酶活測(cè)定方法，脂肪酶水解活力采用p-NP法，磷脂酶D水解酶活力采用酶聯(lián)比色法，酯合活力采用棕櫚酸乙酯法，轉(zhuǎn)酯活力采用DHA甘油酯法。復(fù)篩結(jié)果顯示538株初篩菌株中具有脂肪酶水解活力的菌株有295株;具有PLD水解活力菌株有293株;具有酯合成活力的菌株有138株;具有酯交換活力的菌株有23株。具有較高水解活力的菌株有57株;較高PLD水解活力的菌株有

3、55株;較高酯合活力的菌株有3株。其中水解酶和PLD酶的相關(guān)度為45.08％，水解酶和酯合酶的相關(guān)度為27.5％，酯合酶和酯交換酶的相關(guān)度為82.1％。我們對(duì)部分南海特異性菌株進(jìn)行了16S rDNA鑒定分析，發(fā)現(xiàn)變形桿菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中嗜冷菌、芽孢桿菌、交替假單胞菌為優(yōu)勢(shì)菌屬。
　　脂肪酶庫(kù)中538號(hào)菌株經(jīng)過(guò)16S rDNA鑒定為麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)，通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE

4、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析獲得電泳純蛋白條帶。蛋白質(zhì)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其屬于Ⅰ型磷脂酶含有GxSxG保守序列，相對(duì)分子質(zhì)量為41.8 KD，等電點(diǎn)為8.86。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)該酶最適的催化溫度為40℃，最適pH為7-8，在10-40℃內(nèi)能夠保持酶活的穩(wěn)定性，在pH5-12的范圍內(nèi)能夠維持80％以上活力，金屬離子Fe3+和化學(xué)試劑SDS能夠抑制90％以上的酶活。
　　磷脂酶D（Phospholipid D，EC3，1.4.4，縮寫PLD）能夠

5、催化水解磷脂分子中4位酯鍵，生成磷脂酸和有機(jī)堿;同時(shí)，還能通過(guò)堿基交換反應(yīng)催化各種羥基化合物與磷脂堿基結(jié)合形成新的磷脂。目前報(bào)道的大部分PLD的水解活性遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)堿基活性，這限制了其在制備單一磷脂和稀有磷脂等磷脂改性過(guò)程的應(yīng)用。本研究以脂肪酶庫(kù)中具有PLD水解活力菌株及大豆磷脂殘?jiān)鼮闃悠泛Y選具有堿基交換活性的PLD菌株，并將其用于磷脂酰絲氨酸合成。通過(guò)大量的篩選我們共獲得了6株具有磷脂酰絲氨酸合成能力菌株，分別對(duì)其進(jìn)行了16S rDNA鑒