一種耐熱堿性脂肪酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶(Talaromyces thermophilus lipase，TTL)具有優(yōu)異的耐熱、耐堿性能，在造紙、廢紙脫墨、含酶洗滌劑生產(chǎn)、生物柴油制備、手性化合物拆分等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。但嗜熱踝節(jié)菌自身產(chǎn)酶水平較低，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。本文對(duì)嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了該基因在畢赤酵母和里氏木霉中的重組與表達(dá)，論文取得的主要研究結(jié)果如下：
　　根據(jù)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的偏好性對(duì)嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶基因進(jìn)行了

2、密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因連接到pPIC9K載體的AOX1啟動(dòng)子和α信號(hào)序列之后，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPIC9K-TTL。電擊將此載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母基因組中，并通過(guò)G418抗性篩選得到了220株轉(zhuǎn)化子，PCR技術(shù)檢測(cè)表明外源脂肪酶基因已穩(wěn)定整合到重組畢赤酵母的基因組中。對(duì)重組轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，在1.5％甲醇誘導(dǎo)、初始畢赤酵母濃度為3.5×108細(xì)胞/mL、發(fā)酵液初始pH值6.0的條件下，脂肪酶活力可達(dá)到156 IU/mL。SDS-P

3、AGE結(jié)果顯示:重組子發(fā)酵液在39kDa處有一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，與嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶分子量一致。實(shí)驗(yàn)表明:嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶基因已在畢赤酵母細(xì)胞中得到了成功表達(dá)和胞外分泌。
　　對(duì)嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶基因在里氏木霉中的異源表達(dá)進(jìn)行了研究，為外源基因在里氏木霉中的表達(dá)構(gòu)建了高效的轉(zhuǎn)化體系:在原生質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)，將預(yù)處理8h后的里氏木霉孢子用10 mg/mL蝸牛酶酶解1h，調(diào)整原生質(zhì)體濃度為5×108細(xì)胞/mL，在PEG6000介導(dǎo)下進(jìn)行外

4、源基因轉(zhuǎn)化可得到較高轉(zhuǎn)化效率;農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化時(shí)，選用OD600為0.8的農(nóng)桿菌EHA105和預(yù)萌發(fā)3h的里氏木霉孢子混合均勻，在添加200μM乙酰丁香酮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上于24℃、pH5.3環(huán)境下進(jìn)行共培養(yǎng)，此條件下可得到較高轉(zhuǎn)化效率。相比原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的操作周期更短，效率更高，轉(zhuǎn)化子更穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化子的異源蛋白表達(dá)水平也較高，是將外源基因轉(zhuǎn)入里氏木霉基因組中的有效手段。
　　針對(duì)里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性對(duì)tt

5、l基因進(jìn)行優(yōu)化，將密碼子優(yōu)化后的基因插入到含有里氏木霉cbh1啟動(dòng)子、信號(hào)肽和終止子的表達(dá)盒中，以此構(gòu)建含有潮霉素抗性標(biāo)記的雙元載體pCB-H-PstT。采用原生質(zhì)體介導(dǎo)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化將重組載體轉(zhuǎn)入里氏木霉細(xì)胞中，通過(guò)兩步法篩選方案得到重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子。搖瓶發(fā)酵72h時(shí)重組子的脂肪酶活力可達(dá)241IU/mL。PCR和SDS-PAGE檢測(cè)中可發(fā)現(xiàn)明顯的ttl基因和相應(yīng)的堿性脂肪酶蛋白條帶，這表明外源ttl基因已在里氏木霉中得到成功表達(dá)

6、和胞外分泌。
　　為了克服里氏木霉隨機(jī)轉(zhuǎn)化的不確定性并進(jìn)一步提高脂肪酶的表達(dá)水平，對(duì)嗜熱踝節(jié)菌脂肪酶基因在里氏木霉中的定向整合表達(dá)進(jìn)行了研究。以新鮮里氏木霉菌絲的基因組DNA為模板，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增出cbh1基因的左翼(1.4kb)和右翼序列(1.5kb)，將此同源臂和脂肪酶基因表達(dá)盒PstT進(jìn)行連接（總長(zhǎng)約6kb），構(gòu)建含有潮霉素抗性標(biāo)記的定向整合表達(dá)載體pCB-H-LER。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉基因組中得到里氏木霉定向整合

7、轉(zhuǎn)化子。在乳糖濃度為3％、酵母粉濃度為0.9％、pH值為5.5的條件下，轉(zhuǎn)化子的脂肪酶活力可達(dá)375IU/mL，沒(méi)有檢測(cè)到纖維二糖水解酶活性。SDS-PAGE分析表明轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液可檢測(cè)到相應(yīng)的堿性脂肪酶蛋白條帶，而沒(méi)有纖維二糖水解酶條帶。這表明外源脂肪酶基因已經(jīng)定向整合到里氏木霉cbh1基因位點(diǎn)上，并抑制了里氏木霉自身纖維二糖水解酶的表達(dá)，從而提高了異源脂肪酶的表達(dá)水平。
　　酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:來(lái)源于里氏木霉和畢赤酵母的重組

8、脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)較為相似，重組畢赤酵母脂肪酶在pH8.0到10.5條件下具有明顯的催化活性，在pH9.5催化活性最高;在40℃至70℃條件下催化活性明顯，其最適反應(yīng)溫度為60℃;它對(duì)高溫和強(qiáng)堿環(huán)境表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐受性，在60℃、pH11的條件下處理一個(gè)小時(shí)后，仍可維持最高酶活力70％以上。其催化穩(wěn)定性良好，可抵抗脂肪酸聚集引起的變性。Ca2+對(duì)脂肪酶有輕微的促進(jìn)作用，Na+和K+對(duì)TTL的影響不大，Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+