EV71可溶性2C蛋白的原核表達(dá)及純化.pdf

1、目的:
　　本課題采用生物信息學(xué)方法、選用不同表達(dá)載體克隆表達(dá)EV712C蛋白，最終獲得高純度、性狀均一、可正確折疊的可溶性蛋白，為蛋白質(zhì)的晶體篩選奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1. EV71生物信息學(xué)分析
　　從NCBI數(shù)據(jù)庫下載EV71(200804株)的2C的基因序列和氨基酸序列，采用Protparam軟件、Protean軟件、TopPred2服務(wù)器、Pfam軟件、SMART軟件分別對EV712C蛋白的基本理

2、化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、疏水性、核心結(jié)構(gòu)域等信息進(jìn)行初步預(yù)測，根據(jù)氨基酸的疏水性分析結(jié)果和功能結(jié)構(gòu)域分布，設(shè)計6個不同長度的氨基酸片段。
　　2. 重組EV712C截短片段基因克隆
　　以EV71全長基因組A12質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物:2C-91aa-BamHⅠ-5、2C-118aa-BamHⅠ-5、2C-256aa-XhoⅠ-3T、2C-296aa-XhoⅠ-3T、2C-316aa-XhoⅠ-3T。對上述截取的6個2C片段進(jìn)行PC

3、R擴(kuò)增，將擴(kuò)增后獲得的DNA片段分別連接至帶有His標(biāo)簽的pGl01載體和帶有MBP促溶標(biāo)簽的psj8載體上，構(gòu)建12個重組質(zhì)粒:6個包含pGl01載體-2C截短片段的重組質(zhì)粒和6個psj8載體-2C截短片段的重組質(zhì)粒。酶切鑒定、測序正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)后獲得工程菌。
　　3. EV712C截短蛋白表達(dá)純化、晶體普篩
　　將上述工程菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600在0.6-0.8之間，0.6m

4、M濃度IPTG、20℃低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)16h。收集菌液進(jìn)行超聲破碎，低溫高速離心收集上清液。將pGl01載體-2C截短蛋白的上清液加樣到鎳離子親和層析柱上，使用含有咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。將psj8載體-2C截短蛋白的上清液加樣到MBP TrapTMHp柱，使用含有咪唑和10mM麥芽糖的緩沖液洗脫融合有MBP標(biāo)簽的目的蛋白。采用SDS-PAGE電泳對超聲破碎菌液(CE)、高速離心上清(S)、流過鎳柱蛋白樣品(FL)、重懸緩沖液沖洗鎳

5、柱后的蛋白樣品(W)、洗脫緩沖液沖洗鎳柱后的蛋白樣品(ELU)鑒定蛋白表達(dá)及可溶性情況。選擇CE、ELU條帶單一、清晰、量大的可溶psj8載體-2C截短蛋白M1和M4進(jìn)一步采用凝膠過濾親和層析柱進(jìn)行純化，采用坐滴法對純化得到的2C蛋白進(jìn)行晶體普篩。
　　結(jié)果:
　　1. EV712C截短片段設(shè)計
　　根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，本課題共截取了2C蛋白的6個基因片段。片段1為2C的91aa-256aa，包含完整ATP酶結(jié)構(gòu)域

6、和RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域N端。片段2為2C的91aa-296aa，包含完整ATP酶結(jié)構(gòu)域、RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域N端、AWS domain。片段3為2C的91aa-316aa，包含完整ATP酶結(jié)構(gòu)域、完整RNA解旋酶、AWS domain。片段4為2C的118aa-256aa，包含完整ATP酶結(jié)構(gòu)域和RNA解旋酶中間片段，是最小片段。片段5為2C的118aa-296aa，包含完整ATP酶結(jié)構(gòu)域、RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域中間片段和AWS domain。

7、片段6為2C的118aa-316aa，包含完整ATP酶結(jié)構(gòu)域、RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域C端、AWS domain。
　　2. 重組EV712C截短片段基因克隆
　　PCR擴(kuò)增獲得了EV712C蛋白6個截短片段，并分別連接到pGl01載體和psj8載體上，成功構(gòu)建了pGl01載體-2C截短片段、psj8載體-2C截短片段共12個重組質(zhì)粒。鑒定正確的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至E coli BL21(DE3)，獲得工程菌。
　　3. EV71

8、2C截短蛋白表達(dá)純化、晶體普篩
　　SDS-PAGE結(jié)果顯示:含有pGl01表達(dá)載體的2C蛋白和pjs8載體的2C蛋白在E.coliBL21(DE3)中均有表達(dá)，蛋白表達(dá)的分子量大小與預(yù)期一致。pGl01載體-2C截短蛋白難溶。相反，帶有MBP促溶標(biāo)簽的psj8載體-2C蛋白可溶。凝膠過濾層析結(jié)果顯示峰值高尖，表明M1和M4蛋白純度較高、性狀均一。晶體普篩尚未發(fā)現(xiàn)衍射良好的晶體。
　　結(jié)論:
　　1. psj8載體-2