淇河鯽MSTN基因相關microRNA的篩選與功能研究.pdf

1、淇河鯽(Carassius auratus in Qihe River)屬于銀鯽的一種，天然雌核發(fā)育，脊背寬厚是區(qū)別于其它銀鯽魚最主要的特征。目前在淇河鯽育種、疾病免疫、飼料營養(yǎng)等方面已開展較多研究，但是淇河鯽生長性狀相關的基礎研究還相對薄弱，其脊背寬厚的生長機制尚不清楚。肌肉生長抑制素基因(myostatin，MSTN)是一種負調(diào)控因子，它最主要功能是調(diào)節(jié)動物的骨骼肌肉生長發(fā)育。microRNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈小RN

2、As，近年來它的作用和功能越來越多地被發(fā)掘。miRNAs技術的發(fā)展為探索淇河鯽脊背寬厚這一問題開辟了一條新的途徑。提取淇河鯽總RNA，克隆，得到淇河鯽MSTN3'UTR序列。根據(jù)MSTN3'UTR序列通過TargetScans等軟件預測出相關miRNAs，再利用RNAhybrid軟件進行驗證，最終選取miR-181a和miR-181b作為候選miRNAs。以肌肉總DNA為模板，獲得pri-miR-181a和pri-miR-181b全長。

3、構建真核表達載體和miRNA慢病毒載體，通過雙熒光檢測和熒光原位雜交技術分別從分子水平和組織細胞定位方面確定MSTN和miR-181a、miR-181b之間的相互關系。采用qRT-PCR分析miR-181a、miR-181b和MSTN在淇河鯽腦、肌肉和心臟等8個組織的表達情況以及miR-181a、miR-181b和MSTN在胚胎發(fā)育及其在前期生長不同階段的表達情況。由此進一步揭示淇河鯽肌肉生長相關基因間的多層次網(wǎng)絡調(diào)控模式，探索淇河鯽肌

4、肉生長機制。
　　1、淇河鯽MSTN基因3'UTR的克隆
　　提取總RNA，克隆得到MSTN基因3'UTR，拼接后獲得3'UTR長度是865bp。在NCBI中，經(jīng)過Blast比對發(fā)現(xiàn)，得到片段與鯉形目魚類相似度較高，尤其與南亞野鯪(Labeo rohita)(91％，KR052242.1)和鯉魚(Cyprinus carpio)(92％，LN590705.1)，淇河鯽(Carassius auratus in Qihe ri

5、ver)(88％，KC851952.1)同源性最高。
　　2、淇河鯽MSTN基因相關miRNAs的預測、驗證及克隆
　　根據(jù)MSTN基因3'UTR序列結果，利用RegRNA、Pictar、TargetScan、miRWalk、miRDB等軟件，，預測相關miRNAs，進一步用RNAhybrid軟件驗證，選取可能與MSTN基因相關的miR-181a和miR-181b作為候選miRNAs。從淇河鯽肌肉中提取總DNA，克隆pri-

6、miR-181a和pri-miR-181b。
　　3、真核載體的構建及雙熒光檢測
　　本實驗中把MSTN3'UTR序列和加突變位點的3'UTR序列雙酶切，連接至pmirGLO載體;pri-miR-181a/b雙酶切，連接至Lenti H1載體，分別構建真核表達載體和miRNAs慢病毒載體。構建的兩個載體共轉(zhuǎn)染至293T細胞，雙熒光檢測發(fā)現(xiàn)，miR-181a/b對MSTN基因均可能有一定的抑制作用，此外還發(fā)現(xiàn)miR-181a/

7、b與MSTN還可能存在其他的結合位點共同作用調(diào)節(jié)MSTN基因的表達。
　　4、MSTN和miR-181a在肌肉組織中的表達定位
　　取淇河鯽背部和腹部肌肉，制成石蠟切片，合成探針，檢測MSTN基因和miR-181a在肌肉組織中的表達位置。結果表明，MSTN在肌纖維中表達量較高;miR-181a在肌漿膜中表達量較高，并且在結締組織中也有表達。此外還發(fā)現(xiàn)miR-181a在背部肌肉的表達量低于腹部，在腹部肌纖維中MSTN表達量顯著

8、高于背部，因此推測在背部肌肉中miR-181a對MSTN的抑制作用可能沒有腹部明顯。
　　5、淇河鯽MSTN基因及相關miR-181a/b特異性表達
　　qRT-PCR結果顯示，淇河鯽MSTN基因在不同組織表達量存在顯著性差異，其中心肌和腦中最高，肌肉其次，腎臟最低;胚胎發(fā)育及前期生長不同階段，MSTN基因在原腸胚以前，出生20d表達量顯著高于其他時期。miR-181a在肌肉和鰓的表達豐度顯著高于其他組織，在原腸胚以前和孵化