基于高通量測序技術(shù)的乙肝耐藥基因突變檢測方法研究.pdf

1、一、背景：
　　高通量測序（也稱下一代測序技術(shù)）技術(shù)具有強(qiáng)大的平行測序能力，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。近年來隨著成本的降低和應(yīng)用成熟度的增加，其在臨床基因檢測中備受青睞。高通量測序在用藥指導(dǎo)方面應(yīng)用廣泛，如腫瘤個體化治療基因檢測，相對于傳統(tǒng)檢測，更能全面覆蓋基因變異情況，為患者個體化用藥提供更多參考。
　　乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus：HBV）耐藥問題嚴(yán)重，目前臨床用于治療慢性乙肝的藥物是核苷類藥物，

2、長期治療都會引起不同程度的耐藥現(xiàn)象，密切監(jiān)測耐藥的產(chǎn)生，及時調(diào)整治療方案，已經(jīng)成為醫(yī)患關(guān)注的重點(diǎn)問題。已知與耐藥相關(guān)的絕大部分突變均位于HBV聚合酶基因的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)?，F(xiàn)有的檢測HBV突變方法有聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction：PCR）直接測序法，由于靈敏度的限制，該方法只在群體中特定突變占20％以上時才能檢測到；PCR產(chǎn)物克隆測序法,可大致確定不同序列毒株之間的相對比例有助于發(fā)現(xiàn)混合株，但操作繁瑣且靈敏度

3、有限。此外，實(shí)時定量PCR，限制性片段長度多態(tài)性技術(shù),線性探針反向雜交法在臨床使用中，雖然靈敏度各不相同，但都只能針對特定已知耐藥位點(diǎn)，針對每一個位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)探針/引物，效率低下。
　　目前，下一代測序技術(shù)（Next generation sequencing：NGS）在HBV耐藥檢測中的應(yīng)用較少，尤其是具有實(shí)用價值的NGS檢測HBV耐藥突變方法未見報(bào)道。本文擬建立可用于臨床用藥指導(dǎo)的HBV耐藥基因位點(diǎn)高通量測序檢測方法，該方法能

4、夠?qū)Π℉BV聚合酶基因內(nèi)的全部耐藥相關(guān)區(qū)段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者HBV耐藥位點(diǎn)，為HBV感染患者的個體化治療提供依據(jù)。
　　二、方法：
　　本文的第一部分是基于高通量測序的乙肝耐藥位點(diǎn)檢測方法的建立，首先針對耐藥位點(diǎn)所在區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，并對其進(jìn)行優(yōu)化；然后采用融合引物（Fusion method primer）策略設(shè)計(jì)適用于Thermo Life Ion Torrent PGM平臺及Illumina Miseq高通量測序平臺

5、的引物，即在設(shè)計(jì)好的目標(biāo)特異引物的基礎(chǔ)上，添加適用于高通量測序的接頭和標(biāo)簽序列，以此引物擴(kuò)增乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（Hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid，HBV DNA）獲得上機(jī)文庫。然后進(jìn)行測序操作獲得目標(biāo)區(qū)域的基因序列信息，并對其進(jìn)行分析。本文第二部分對基于高通量測序技術(shù)的乙肝耐藥突變位點(diǎn)檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證和臨床樣本檢測。還利用以上建庫引物，對濃度梯度的HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了文庫構(gòu)建，

6、以評價本方法的靈敏度；利用耐藥位點(diǎn)區(qū)域存在差異的兩種乙肝病毒基因組質(zhì)粒混合模擬樣對高通量測序方法的突變率檢測能力進(jìn)行評價，選B型和C型HBV基因組質(zhì)粒按1:99，5:95，10:90三種比例混合建庫，并在Ion Torrent PGM和 Miseq上進(jìn)行上機(jī)測序，統(tǒng)計(jì)B型、C型兩種HBV DNA差異堿基的檢測效率；采用突變引物構(gòu)建HBV突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，突變型和野生型HBV基因組質(zhì)粒按1:99，5:95，10:90三種比例混合建庫，并在I

7、on TorrentPGM上進(jìn)行測序，統(tǒng)計(jì)突變堿基的檢測效率，對本研究設(shè)計(jì)的高通量測序方法的突變檢出能力進(jìn)行評價。進(jìn)一步，收集了15例慢性乙肝患者血液樣本，用PureLink? Viral RNA/DNA Mini試劑盒提取HBV DNA。患者血清HBV DNA用建立的 Ion Torrent PGM方法檢測，樣本同時進(jìn)行Sanger法測序。
　　三、結(jié)果：
　　1.對使用特異引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測分析產(chǎn)物長

8、度和測序驗(yàn)證序列，結(jié)果表明特異引物擴(kuò)增特異。PCR產(chǎn)物分為三個片段，大小分別是165bp、324bp和135bp，覆蓋的耐藥位點(diǎn)包括L80V/I，I169T，V173L，L180M，A181T/V，T184A，S202G/I，M204I/V/S，V214A，Q215S，N236T，M250V，G1896A。
　　2.設(shè)計(jì)了Ion Torrent PGM的擴(kuò)增子引物和基于Miseq平臺的引物，并對引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了毛細(xì)管電泳檢測，結(jié)

9、果表明產(chǎn)物長度分別為244bp、467bp、320bp和296bp、559bp、218bp，一代測序證明其序列正確，表明測序引物擴(kuò)增正確；對構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各步產(chǎn)物都采用毛細(xì)管電泳檢測，構(gòu)建的質(zhì)粒采用毛細(xì)管電泳檢測和Sanger法一代測序鑒定，結(jié)果顯示 HBV突變質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3.基于Ion Torrent? PGM平臺的融合引物建庫方法檢測靈敏度可達(dá)50IU/mL，建立了適用于Ion Torrent? PGM平臺和Mise

10、q平臺的擴(kuò)增子文庫構(gòu)建方法，該方法可對HBV>50 IU/mL的血清進(jìn)行建庫。對模擬樣中突變率在5%及其以上的位點(diǎn)可很好的檢出（信噪比>10)；對模擬樣中突變率在1%豐度的位點(diǎn)可檢出9/10，（信噪比>10)。15例臨床樣品的檢出8個耐藥位點(diǎn)，這些位點(diǎn)不能被臨床常用的Sanger法檢測到。
　　四、結(jié)論：
　　初步建立了高通量測序檢測 HBV耐藥突變的檢測方法，為臨床動態(tài)監(jiān)測乙肝病毒耐藥位點(diǎn)突變、指導(dǎo)合理臨床用藥奠定了基礎(chǔ)。