實驗動物金黃色葡萄球菌LAMP檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)廣泛存在于空氣和水中，是一種條件致病菌，可以影響鼠群繁育并對動物實驗結(jié)果造成極大的干擾。因此，開發(fā)快速實驗動物金黃色葡萄球菌檢測技術(shù)具有較高的應用價值。環(huán)介恒溫擴增方法(LAMP)能夠特異、靈敏地對目的基因進行擴增，具有簡便、快速和成本低廉等特點，能夠滿足這一需求。
　　 本研究確定了金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)、菌體計數(shù)方法，并制備了金黃色葡萄球菌DNA的試劑盒提取液和熱

2、裂解法粗提提取液，分別作為LAMP檢測的模板。針對金黃色葡萄球菌特異的nuc基因設計4條引物，對反應條件進行優(yōu)化。通過優(yōu)化，設定條件為60℃,40min，Mg2+濃度8mM，dNTP濃度2.0mM，甜菜堿濃度0.8mM時，對金黃色葡萄球菌檢測限為2cfu，且與其它常見實驗動物致病菌未出現(xiàn)交叉反應。反應結(jié)果可通過添加熒光染料SYBRGreenⅠ直接肉眼觀察。
　　 利用設計的金黃色葡萄球菌LAMP法引物，分別對金黃色葡萄球菌ATC

3、C25923以及本實驗室分離、保藏的金黃色葡萄球菌、沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、肺炎克雷伯菌進行擴增。瓊脂糖凝膠電泳顯示，只有金黃色葡萄球菌ATCC25923和本實驗室保藏的金黃色葡萄球菌地方分離株擴增結(jié)果呈陽性。進一步證明了nuc基因的特異性，說明nuc基因可以作為檢測金黃色葡萄球菌的可靠靶序列。
　　 本研究建立的金黃色葡萄球菌LAMP方法具有快速、靈敏、操作簡單、設備要求低的特點，不僅可以應用于實驗動物的金