殼聚糖酶OU01底物結(jié)合與催化機理研究.pdf

1、殼寡糖是具有多種生物學功能的生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、農(nóng)業(yè)等方面都具有廣泛的研究及應用。在殼寡糖的制備方法中，以殼聚糖酶為基礎(chǔ)的酶降解法具有專一性強，酶切效率高，反應條件溫和，環(huán)保等優(yōu)點，正受到越來越多的關(guān)注。迄今為止，已經(jīng)從細菌、植物組織里發(fā)現(xiàn)了多種殼聚糖酶，對殼聚糖酶的基本性質(zhì)、水解方式等都開展了研究。目前，已有三種殼聚糖酶單體的結(jié)構(gòu)得到解析，為殼聚糖酶的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但殼聚糖酶對底物的降解機制仍然不清楚。為此，本論文通

2、過培養(yǎng)酶與底物復合物晶體，解析復合物的三維結(jié)構(gòu)，從分子水平上對殼聚糖酶與底物的結(jié)合機理進行深入研究。本研究選取了酶活性較高的chitosanase OU01為研究對象，主要進行了以下幾個方面的工作:
　　1、從菌株Microbacterium sp.的基因組中克隆了不含信號肽的chitosanase OU01基因。將基因與pGEX-6p-1相連，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中，構(gòu)建了chitosanaseOU01的原核表

3、達系統(tǒng)。通過IPTG誘導成功表達了重組蛋白。通過親和層析、柱上酶切和凝膠過濾層析對重組蛋白進行了分離純化，最終獲得高純度的chitosanase OU01，電泳結(jié)果顯示其分子量在30 kDa左右。
　　2、利用TLC，質(zhì)譜，NMR技術(shù)對chitosanase OU01的動力學參數(shù)、酶解產(chǎn)物、水解動力學進行了研究?；緞恿W參數(shù)如下:Km為4.197 mg/ml，最大反應速率Vmax為0.049μmol/min，催化常數(shù)Kcat為1

4、2，297 min-1，比活力為476.6U/mg.protein;對脫乙酰度大于90％(DDA＞90％)殼聚糖進行充分水解后得到的產(chǎn)物主要為殼二糖和殼三糖;水解脫乙酰度大于99％(DDA＞99％)殼聚糖的整體水解過程表現(xiàn)出先快后慢的非均一性動力學過程。
　　3、參考序列比對，利用定點突變技術(shù)將兩個氨基酸（Glu25與Asp43）分別突變成Ala，獲得無催化活性的突變體，用于與殼六糖底物共混，進行復合物結(jié)晶。經(jīng)過晶體生長條件的篩選

5、與優(yōu)化，獲得了可用于X-射線衍射數(shù)據(jù)收集的復合物晶體。在此基礎(chǔ)上，對復合物晶體結(jié)構(gòu)進行了解析，首次獲得了殼聚糖酶與底物的復合物晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:4OLT;4QWP)。
　　4、復合物結(jié)構(gòu)的解析，進一步從結(jié)構(gòu)角度確定了chitosanase OU01采用的是“inverting”催化機理，并首次闡明了催化關(guān)鍵氨基酸在催化反應中的作用。
　　5、通過復合物結(jié)構(gòu)，首次揭示了chitosanase OU01結(jié)合口袋內(nèi)部與每一個糖

6、單元的相互作用。通過定點突變，進一步驗證了chitosanase OU01結(jié)合口袋內(nèi)部對底物結(jié)合起重要作用的氨基酸。
　　6、綜合復合物結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子對接分析，確定了-2位是chitosanase OU01中的底物特異性識別位點，該位點只能結(jié)合氨基葡萄糖，屬于D-X-X（（-2）-(-1)-(+1))型底物特異性水解酶，該研究對chitosanase水解底物的特異性進行了重新定義。
　　7、通過表面電荷分析與突變體活性

7、驗證，尋找到了結(jié)合口袋之外對長鏈殼聚糖底物的結(jié)合起重要作用的氨基酸Asp40。
　　8、依據(jù)關(guān)鍵氨基酸殘基對不同底物活性的影響及空間結(jié)構(gòu)，對參與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸進行了分類，在此基礎(chǔ)上，闡明了兩類底物（寡糖底物和長鏈底物）與酶的復合物形成機理，并首次提出了長鏈底物與殼聚糖酶的“三步”結(jié)合原理。
　　9、通過復合物與文獻報道的殼聚糖酶單體的結(jié)構(gòu)比較，明確了“非連續(xù)”型殼聚糖酶在結(jié)構(gòu)上的兩個重要特征，一是結(jié)合口袋在水解過程中按