犬弓首蛔蟲卵黃原蛋白基因的克隆、表達及組織分布研究.pdf

1、弓首蛔蟲?。═oxocariasis）主要是由犬弓首蛔蟲（Toxocara canis, T. canis）寄生于宿主小腸而引起的一類寄生蟲病。該病具有世界性分布的特點，有數(shù)據(jù)顯示，世界各地T. canis的感染率為0.9％~64.7%。其感染性蟲卵不僅可以感染犬，還可以感染多種動物及人類，能引起眼睛幼蟲移行癥（Ocular larva migrans, OLM）、神經(jīng)幼蟲移行癥（Nerve larvae migration, NLM）

2、、隱秘幼蟲移行癥（Cryptic larval migration, CLM）和內(nèi)臟幼蟲移行癥（Visceral larva migrans, VLM），導致嚴重的病理綜合征。因此，該病在獸醫(yī)公共衛(wèi)生學上具有十分重要的意義。
　　卵黃原蛋白（Vitellogenin, Vg）是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族成員之一，通常是在卵生非哺乳動物的卵巢外組織中合成，經(jīng)卵黃原蛋白受體（Vitellogenin receptor, VgR）介導的胞吞作用進

3、入卵巢，分解為卵黃蛋白（Yolk protein, YP）、卵黃脂磷蛋白（Lipovitellin, Lv）、卵黃高磷蛋白（Phosvitin, Pv）等功能性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，Vg不僅為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)元素，還具有促進動物卵母細胞的生長和分化、粒子載體、生物標志物、抗氧化活性、免疫防御等多種生理功能。隨著秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）卵黃原蛋白基因的發(fā)現(xiàn)，陸續(xù)展開了對有齒食道口線蟲（Oesophagosto

4、mum dentatum）、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）、毛圓線蟲（Trichostrongylus vitrinus）等寄生蟲卵黃原蛋白的相關研究，而有關犬弓首蛔蟲Vg的研究還未見報道。
　　本論文在實驗室已有的T. canis轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎上，對犬弓首蛔蟲卵黃原蛋白(T. canis-vg, Tc-vg)基因進行了克隆、原核表達和組織定位等相關研究。主要試驗結(jié)果如下：
　　1. Tc-vg基因

5、的生物信息學分析
　　運用分子生物學技術對Tc-vg基因進行了分析，結(jié)果顯示該基因為一個完整的編碼區(qū)序列（Coding sequence, CDS），大小為5082 bp，可編碼1694個氨基酸；理論分子質(zhì)量為198 kDa，等電點為6.19。信號肽在線預測顯示其N端含有一個信號肽，裂解位點在18-19 aa處。由在線軟件分析顯示該蛋白在一級結(jié)構(gòu)上以親水性為主；含有三個功能結(jié)構(gòu)域：Vitellogenin_N、DUF1943(do

6、main of unknown function)以及vWD(von Willebrand factor type D domain)。二級結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲。在線分析TcVg磷酸化位點顯示該蛋白中存在三種主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化蘇氨酸（pThr）、磷酸化酪氨酸（pTyr）和磷酸化絲氨酸（pSer）共44個，分別為7、19、18。亞細胞定位分析為分泌通路；功能預測顯示參與脂質(zhì)分子的轉(zhuǎn)運過程。根據(jù)Blast比對發(fā)

7、現(xiàn)Tc-vg與豬蛔蟲（Ascaris suum）、美洲鉤蟲（Necator americanus）和小桿線蟲（Caenorhabditis briggsae）的相似性高達100%；系統(tǒng)進化分析顯示Tc-vg與A. suum(ERG83573)的親緣關系最近；與N. americanus(XP_013298422)、線蟲（ Pristionchus pacificus, KKA71696)、十二指腸鉤蟲（ Ancylostoma duod

8、enale, KIH69020）、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（ Haemonchus contortus, CDJ93502）、胎生網(wǎng)尾線蟲（Dictyocaulus viviparus, KJH46366）等的親緣關系次之。
　　2. Tc-vwd與Tc-duf1943結(jié)構(gòu)域的克隆
　　運用PCR技術，克隆獲得了Tc-vg基因的兩個功能結(jié)構(gòu)域（ Tc-duf1943和Tc-vwd）。其中，Tc-vwd結(jié)構(gòu)域長度為834 bp，ORF長度

9、為816 bp，編碼272 aa，預測蛋白分子量大小為31.15 kDa，等電點為5.12。犬弓首蛔蟲vWD(T. canis-vWD, TcvWD)蛋白主要參與發(fā)病機理的生物學過程。Tc-duf1943結(jié)構(gòu)域長度為882 bp， ORF大小為864 bp，編碼288 aa，預測成熟蛋白分子量為33.25 kDa，等電點為9.57。犬弓首蛔蟲DUF1943（T. canis-DUF1943, TcDUF1943）蛋白主要具有脂質(zhì)定位和有

10、機物質(zhì)運輸?shù)纳飳W過程。
　　3. Tc-vwd/pET28a與Tc-duf1943/pET28a表達載體的構(gòu)建及原核表達
　　按照 TaKaRa公司的質(zhì)粒提取試劑盒的說明對 Tc-vwd/pMD19-T、Tc-duf1943/pMD19-T和pET28a等質(zhì)粒進行提取，酶切之后目的基因與pET28a進行連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α細胞，平板培養(yǎng)過夜，挑取單個白色菌落培養(yǎng)，PCR、雙酶切及測序鑒定，將測序正確的重組質(zhì)粒

11、Tc-vwd/pET28a與Tc-duf1943/pET28a轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)表達菌，挑取單菌落培養(yǎng)，當OD600值達到0.6~1.0時，加入IPTG進行誘導表達，同時對菌液進行IPTG濃度梯度和時間梯度的優(yōu)化，篩選最佳的誘導條件。結(jié)果顯示重組蛋白TcvWD與TcDUF1943均以包涵體形式存在，其中TcvWD大小約為40 kDa，TcDUF1943大小約為35 kDa；TcvWD蛋白于37℃，0.4 mM的IPT

12、G誘導6 h時表達量最高，TcDUF1943在37℃，0.4 mM的IPTG誘導4h時表達量最高。
　　4. TcvWD多克隆抗體的制備及Western blot檢測
　　對Tc-vwd/pET28a/BL21進行大量表達，離心收集包涵體沉淀，8 M尿素溶解，純化上清，將重組蛋白TcvWD免疫新西蘭白兔，2-3周免疫一次，共免疫四次，當效價大于1:50000時進行最終采血制備抗血清，對所得抗體進行效價、濃度、純度測定。結(jié)果顯

13、示TcvWD融合蛋白純度較高，所得抗體效價為1:512000，濃度為0.82 mg/ml，純度合格。Western blot顯示TcvWD能夠與免疫抗血清反應，而不與免疫前血清反應，即TcvWD具有良好的特異性，可用于免疫組化試驗。
　　5. Tc-vg特異性表達和TcVg免疫組織化學分析
　　運用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）方法檢測Tc-vg基因的組織差異表達