嗜熱四膜蟲小核特異組蛋白Mlh1的定位和功能分析.pdf

1、在真核細胞中，染色質(zhì)是由DNA，組蛋白，非組蛋白以及少量的RNA組成的。染色質(zhì)的基本單位是核小體。核小體是由146 bp的左手超螺旋DNA纏繞著組蛋白八聚體組成的。組蛋白八聚體是由進化上比較保守的核心組蛋白H2A，H2B，H3， H4各兩個單體構(gòu)成。連接組蛋白則可以將DNA鎖定在核小體上。在不同生物中，連接組蛋白在進化上不保守，在維持基因組的穩(wěn)定性，特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，染色質(zhì)重塑，以及DNA損傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用。
　　嗜

2、熱四膜蟲（Tetrahymean thermophila）具有傳統(tǒng)纖毛蟲特異的大核和小核的細胞雙核體系。大核和小核中具有結(jié)構(gòu)不同的組蛋白H1。小核特異組蛋白MLH1（micronuclear linker histone）在生長期表達量低，而在有性生殖時期表達水平顯著提高，然而其具體的生物學(xué)功能并不清楚。本研究對Mlh1在四膜蟲中的功能進行了系統(tǒng)分析研究，獲得主要結(jié)果如下：
　　1. MLH1基因的生物信息學(xué)分析 MLH1（TTH

3、ERM_00471820）在四膜蟲大核基因組中無內(nèi)含子序列，開放閱讀框1902 bp，編碼633個氨基酸。含有21.5％的賴氨酸和23.1%的絲氨酸。序列中含有一個較為保守的HMG-box結(jié)構(gòu)域（93-158aa），該結(jié)構(gòu)域?qū)儆?II/III類的 HMG-box超家族。與四膜蟲高遷移率族蛋白 HmgB3（TTHERM_00155590）的HMG-box有35%的一致性。MLH1在營養(yǎng)生長期和饑餓前期有較低的表達，饑餓后期幾乎不表達，而在

4、有性生殖時期表達水平顯著提高，有性生殖時期6h達到最高。
　　2. Mlh1在不同發(fā)育階段的定位 Mlh1在生長發(fā)育的不同時期會水解成不同的片段α，β，γ，δ。分別構(gòu)建了含HA-tag和Flag-tag的pXS75-MLH1、pXS75-MLH1-α、pXS75-MLH1-β、pXS75-MLH1-γ、 pXS75-MLH1-δ載體，轉(zhuǎn)化嗜熱四膜蟲細胞中，利用巴龍霉素抗性篩選出突變株。免疫熒光定位分析表明，在營養(yǎng)生長期 HA-Ml

5、h1定位在小核上，而HA-α，HA-β，HA-γ，HA-δ定位在胞質(zhì)中，表明全長Mlh1對于小核連接組蛋白的入核是必須的。營養(yǎng)生長期HA-Mlh1定位在小核上，而Mlh1-Flag沒有定位在小核上，表明全長 Mlh1入核后很快發(fā)生了水解。在有性生殖早期， HA-Mlh1定位在小核上，且定位信號不斷擴大，定位模式類似于紡錘體結(jié)構(gòu)。在Crescent時期，HA-Mlh1可以與α-tubulin共定位于小核上。在小核完成第二次減數(shù)分裂后，HA

6、-Mlh1定位信號消失。結(jié)果表明，Mlh1參與減數(shù)分裂小核的拉伸。
　　3. MLH1的過表達導(dǎo)致四膜蟲異常的有性生殖0.15μg/ml的Cd2+誘導(dǎo)生長期突變株2 h，通過DAPI染細胞核DNA，顯微鏡下進行突變株有性生殖時期核發(fā)育觀察，發(fā)現(xiàn)突變株在有性生殖期間出現(xiàn)無規(guī)則的小核和松散的染色質(zhì)，突變株不能完成有性生殖。核發(fā)育概率統(tǒng)計顯示，MLH1的過表達抑制了合子核的形成和發(fā)育，減數(shù)分裂后形成的配子大部分凋亡，少部分能發(fā)育到anl

7、agen時期，之后配對細胞分開。
　　4. MLH1的敲除影響四膜蟲的有性生殖構(gòu)建敲除載體pBsr-MLH1后，基因槍轉(zhuǎn)化入四膜蟲細胞內(nèi)，通過殺稻溫菌素梯度濃度篩選得到穩(wěn)定突變株ΔMLH1。缺對PCR檢測結(jié)果表明突變株存在小核染色體的丟失。核發(fā)育概率統(tǒng)計和γ-H2A.X定位信號結(jié)果顯示，突變株在第二次減數(shù)分裂后，選擇核不能完成DNA斷裂修復(fù)，之后配子凋亡。結(jié)果暗示，MLH1的缺失會影響選擇核的DNA斷裂修復(fù)，進而影響合子核的發(fā)育及

8、后期的有性生殖進程。Mlh1可能和DNA損傷修復(fù)相關(guān)。
　　5. MLH1和HMGB3可能存在功能上的補償通過四膜蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)MLH1和高遷移率蛋白HMGB3有著相似的表達圖譜。此外，Mlh1和HmgB3有著相似的一級氨基酸序列結(jié)構(gòu)特性。RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)在ΔMLH1細胞中，HMGB3的表達水平較野生型細胞有了明顯的提高；在ΔHMGB3細胞中，MLH1的表達量也較野生型細胞有了明顯的提升。 MLH1和HMGB

9、3的雙敲除突變株對MMS較為敏感，且有性生殖缺陷比 MLH1的單敲除細胞株表型嚴重。以上結(jié)果表明 MLH1和HMGB3可能存在功能上的補償作用。
　　本研究首次對MLH1在四膜蟲有性生殖時期的定位和功能進行了系統(tǒng)分析；有性生殖早期，HA-Mlh1定位在小核上，且定位信號不斷擴大，定位模式類似于紡錘體結(jié)構(gòu)。在Crescent時期，HA-Mlh1可以與α-tubulin共定位于小核上。MLH1的過表達不僅抑制了合子核的形成和發(fā)育，還形