AαC誘導(dǎo)HepG2和A549細(xì)胞基因毒性及氧化應(yīng)激作用研究.pdf

1、雜環(huán)胺是在煎炸、燒烤食品、煙氣及汽車(chē)尾氣中廣泛存在的一類(lèi)有害物質(zhì)。2–氨基–9–氫–吡啶并[2,3–b]吲哚（AαC），主要存在于卷煙煙氣中，其在主流煙氣中的釋放量約為60-258ng/支，由于 AαC是可疑的人體致癌成分（2B類(lèi)致癌物），并且，吸煙會(huì)引起吸煙者AαC暴露量的顯著增加。因此，研究AαC的基因毒性作用對(duì)煙氣危害性評(píng)價(jià)具有重要意義。但以往研究主要集中在食物中含量較高的雜環(huán)胺，如，IQ、PhIP等，有關(guān)AαC的基因毒性研究較少

2、；已有研究表明一些雜環(huán)胺的基因毒性與其代謝活化和其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)，而AαC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用及其與基因毒性的關(guān)系并不清楚。本研究以人肝癌細(xì)胞（HepG2）和人肺泡上皮細(xì)胞（A549）作為模型，評(píng)估了AαC的基因毒性，并對(duì)氧化應(yīng)激在基因毒性機(jī)制中的作用進(jìn)行了研究，分析了AαC主要羥基化代謝產(chǎn)物，并探討了AαC羥基代謝活化對(duì)AαC誘導(dǎo)的氧化DNA損傷的影響。論文內(nèi)容主要包括以下三部分：
　　一、以HepG2和 A549細(xì)胞為模型，

3、研究了AαC的基因毒性及氧化應(yīng)激在其機(jī)制中的作用。實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的AαC對(duì)HepG2和 A549細(xì)胞染毒（HepG2細(xì)胞染毒劑量為5、10、15、20μg/ml，A549細(xì)胞染毒劑量為5、10、20、30μg/ml），對(duì)照組用0.1％DMSO進(jìn)行染毒，采用凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞DNA損傷情況，對(duì)AαC的遺傳毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以2’，7’–二氫二氯熒光素(DCFH)熒光探針?lè)y(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平；用 GSH/GSSG

4、比率測(cè)定試劑盒測(cè)定GSH/GSSG比率，評(píng)估了 AαC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激效應(yīng)；通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）測(cè)定8-羥脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)的水平，評(píng)估了DNA氧化損傷。結(jié)果表明： AαC作用細(xì)胞后，與未處理細(xì)胞相比，HepG2和 A549細(xì)胞 DNA斷裂的尾長(zhǎng)，尾部DNA含量，Olive尾距顯著增高，并且細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05或0.01)；細(xì)胞內(nèi)ROS水平比未處理細(xì)胞明顯增加（P﹤0.05或P﹤0.

5、01）；細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比率則明顯降低（P﹤0.05或P﹤0.01）。結(jié)果暗示，AαC使兩種細(xì)胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激效應(yīng)，并造成細(xì)胞DNA氧化損傷；8-OHdG水平與Olive尾距呈正相關(guān)（R2=0.746），暗示AαC對(duì)兩種細(xì)胞的基因毒性可能與ROS造成的氧化性DNA損傷有關(guān)。
　　二、為了探討 AαC羥基代謝活化在 AαC基因毒性中的作用，采用HPLC-MS/MS方法檢測(cè)對(duì)AαC在細(xì)胞中的羥基化代謝物進(jìn)行了定性和相對(duì)定量分析。

6、結(jié)果表明：在HepG2和A549細(xì)胞孵育體系中，AαC的羥基化代謝產(chǎn)物均為5種，活化代謝產(chǎn)物1種，為N-OH-AαC，解毒產(chǎn)物4種，為6-OH-AαC、5-OH-AαC、4-OH-AαC、3-OH-AαC。但AαC在HepG2和A549細(xì)胞中各代謝產(chǎn)物的比例存在差異，活化代謝產(chǎn)物的比例分別為7.85%和31.54%，HepG2細(xì)胞中6-OH-AαC產(chǎn)物比例最高占總代謝產(chǎn)物的70.17%，在A549細(xì)胞中4-OH-AαC產(chǎn)物比例最高，占總

7、代謝產(chǎn)物的38.41%，；HepG2細(xì)胞中5種代謝產(chǎn)物的量均高于A549細(xì)胞，這可能是因?yàn)閮煞N細(xì)胞的酶活性存在差異。
　　三、為了探討AαC羥基代謝活化對(duì)AαC誘導(dǎo)的氧化DNA損傷的影響，以HepG2細(xì)胞為模型，用10和20μg/mL的AαC無(wú)血清培養(yǎng)基染毒，為了使系統(tǒng)具有不同的代謝活化能力，每個(gè)染毒劑量分別加入濃度為0、0.1、0.2、0.5、1mg/mLS9溶液，用HPLC-MS/MS對(duì)細(xì)胞羥基化代謝產(chǎn)物及8-OHdG含量進(jìn)行