運用CRISPR-cas9基因編輯技術敲除Tshr基因構建CH大鼠模型的研究.pdf

1、先天性甲狀腺功能減癥（Congenital Hypothyroidism CH）是一種新生兒常見的內分泌代謝性疾病，臨床表現為患兒體格發(fā)育遲滯和智能發(fā)育嚴重障礙。正是因為其高發(fā)病率且可導致機體多個器官的發(fā)育遲滯，所以我們有必要進一步深入研究CH影響器官正常發(fā)育的作用機制。由于倫理學問題，人類不可能在對CH患者做出診斷后不進行治療而繼續(xù)進行研究，所以在體研究只能依靠CH動物疾病模型。但因為目前世界上缺乏基因敲除的CH大鼠模型，所以研究者獲

2、取CH大鼠模型都是通過藥物誘導的，而這顯然無法真正模擬由于基因突變所造成的CH對大鼠機體發(fā)育的影響，所以通過敲除調控甲狀腺發(fā)育或者甲狀腺激素合成的相關基因以構建CH大鼠模型成為了CH深入研究的必要前提。本項研究在世界上首次運用CRISPR/cas9基因編輯技術通過敲除促甲狀腺激素受體（Tshr）基因成功構建了CH大鼠疾病模型，為今后最終明確甲狀腺激素在器官發(fā)育過程中的作用機制以及CH的病理機制提供了研究基礎。
　　研究主要內容：<

3、br>　　一、目的質粒的構建和RNA體外轉錄：
　　將pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9質粒（addgene Plasmid＃42230）進行目的基因的克隆，即通過酶切、連接和轉化擴大培養(yǎng)等步驟獲取目的質粒。目的質粒構建成功后轉染大鼠BRL細胞進行敲除效率驗證。選取效率高的目的質粒進行體外轉錄，分別獲得cas9RNA和sgRNA。
　　二、受精卵顯微注射及移植
　　對清潔級SD野生型雌鼠促

4、排卵獲取受精卵，運用顯微注射平臺對受精卵注射cas9RNA和sgRNA混合物，再選取注射成功的優(yōu)質受精卵移植回清潔級SD假孕雌鼠輸卵管內，移植完成后待正常分娩。
　　三、F0代幼鼠基因型的鑒定及脫靶情況的分析
　　在F0代幼鼠出生后第21天取幼鼠鼠尾提取基因組DNA，進行基因測序分析。測序結果出現套峰后，對PCR產物進行載體亞克隆，分析基因敲除結果，選取5個可能存在的脫靶位點進行基因測序分析。
　　四、F0代大鼠表型的