MicroRNA-145-ADD3通路在膽道閉鎖肝纖維化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過分析ADD3、microRNA-145（miR-145）在BA肝組織的表達(dá)水平變化，探討miR-145-ADD3信號通路在BA纖維化的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　選取我院2015年9月~2016年10月期間收治的臨床及病理均診斷為膽道閉鎖的患兒14例（研究組），對照組選取同期年齡的肝功能正常的膽管擴(kuò)張（Choledochal Cyst,CC）癥患兒14例。首先提取BA組及CC組中肝組織RNA后采用熒光實

2、時定量（Real-time quantitative PCR，qPCR）分別檢測兩組的ADD3和miR-145的表達(dá)水平，同時利用免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）檢測兩組患兒肝組織中ADD3的表達(dá)水平；構(gòu)建miR-145模擬物、miR-145-5p抑制劑、miR-145-3p抑制劑、空白載體的慢病毒，分別轉(zhuǎn)染至肝星狀細(xì)胞（LX-2 cells）內(nèi)，并通過qPCR和蛋白質(zhì)印跡（western blot，W

3、B）法分別檢測轉(zhuǎn)染后ADD3在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，以及p-akt在蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；將ADD3的3’非編碼區(qū)（3’UTR）及其突變體克隆至Promega載體中，構(gòu)建ADD3野生型和突變型重組質(zhì)粒載體，與miR-145-5p模擬物、miR-145-5p抑制劑、空白對照組在LX-2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，通過雙螢光素酶報告基因技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性，驗證miR-145-5p-ADD3存在直接結(jié)合及調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　

4、　BA組肝組織中miR-145-5p的表達(dá)水平較CC組低（ρ=0.0267），而ADD3 mRNA的表達(dá)水平較CC組高（ρ=0.0118），IHC同樣發(fā)現(xiàn)ADD3在BA組肝組織中的呈現(xiàn)高表達(dá)；轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物后ADD3在mRNA及蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)均受抑制；雙螢光素酶報告基因顯示，與空白對照組相比，miR-145-5p模擬物ADD3野生型報告基因的螢光素酶活性顯著降低（ρ=0.0082），而miR-145-5p抑制劑ADD

5、3野生型報告基因的螢光素酶活性較miR-145-5p模擬物明顯升高（ρ=0.0186），miR-145-5p模擬物、miR-145-5p抑制劑、空白對照組對ADD3突變型螢光素酶活性均無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.膽道閉鎖患兒肝組織中ADD3的表達(dá)水平明顯升高，而miR-145-5p的表達(dá)水平明顯降低；
　　2.雙熒光素酶報告基因顯示miR-145-5p靶向結(jié)合于ADD3，并在ADD3 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)翻譯水平