KLF4在2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生中的作用及可能的機制.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病的嚴重并發(fā)癥。研究DN時蛋白尿的發(fā)生發(fā)展機制，對于預防DN，以及采取針對性的措施延緩DN的發(fā)展，從而提高2型糖尿病患者的生活質(zhì)量和生活水平有著重要臨床和社會意義。
　　2型糖尿病時，足細胞之間的裂隙（slit diaphragm，SD）結(jié)構消失，足突融合（foot process effacement），最終導致蛋白尿的發(fā)生。足細胞裂孔膜上的nephri

2、n、CD2AP，足細胞足突上的α-actin4，足細胞和腎小球基底膜之間的integrinβ1等蛋白分子的丟失都會造成足細胞損傷，導致蛋白尿的發(fā)生。
　　Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子（krüppel-like factors，KLFs）屬于核轉(zhuǎn)錄因子超家族，調(diào)節(jié)細胞的多種生物過程，包括增殖、分化、生長、發(fā)育。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在腎臟的發(fā)育和維持其正常生理功能中也具有重要的作用。
　　我們在前期的實驗中，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病小鼠

3、腎臟中KLF4的mRNA的表達水平顯著下降。結(jié)果初步提示，KLF4可能與2型糖尿病腎病的發(fā)生有關。阿霉素（adriamycin，ADM）誘導的腎病小鼠的尿蛋白水平顯著升高，同時足細胞中，KLF4和nephrin的表達也是顯著降低的。相反，增加腎病小鼠足細胞中KLF4的表達又可以升高nephrin的表達，降低尿蛋白水平。那么KLF4表達下降是否與2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生有關？其機制如何？針對這一問題，本實驗以2型糖尿病的db/db小鼠以

4、及高脂環(huán)境中的足細胞作為實驗對象，研究KLF4在2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生中的作用及其機制，為認識2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的分子機制提供實驗數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.實驗動物
　　采用db/db小鼠作為2型糖尿病動物模型，用尾靜脈注射過表達KLF4腺病毒（Ad-GFP-KLF4）的方法改變db/db小鼠腎內(nèi)KLF4的表達水平。
　　2.細胞株
　　條件性永生化小鼠足細胞。用棕櫚酸（C16:0）模擬2型糖尿病

5、的高脂環(huán)境。用過表達KLF4腺病毒感染足細胞，改變KLF4的表達水平。
　　3.標本收集
　　分別于第8周、12周、16周收集尿液并取腎臟組織。腎臟組織分別用于Western blot、PCR、 PAS染色、免疫組化實驗等。
　　4.細胞收集
　　對數(shù)生長期足細胞經(jīng)相應濃度 BSA、C16:0、C16:0+Ad-GFP、C16:0+Ad-GFP-KLF4處理48小時后，收集細胞進行Western blot及PCR

6、分析實驗。
　　5.Lowrry法測定小鼠24小時尿蛋白總量。
　　6.實時定量PCR檢測KLF4在2型糖尿病小鼠腎臟中的mRNA表達水平，檢測nephrin和integrinβ1在高脂環(huán)境小鼠足細胞的mRNA表達水平。
　　7.Western blot檢測KLF4在2型糖尿病小鼠腎臟中的蛋白表達水平，以及KLF4、nephrin、α-actin4和integrinβ1在高脂環(huán)境小鼠足細胞的蛋白表達水平。
　　8

7、.PAS染色觀察小鼠腎臟腎小球結(jié)構
　　9.免疫組織化學分析2型糖尿病小鼠腎小球中nephrin、CD2AP、α-actin4、integrinβ1和integrinα3的蛋白表達水平。
　　10.數(shù)據(jù)處理
　　采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理分析，對所測定結(jié)果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)用x±SD表示，兩組間比較用雙尾-T檢驗分析。P<0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1. KLF4在

8、db/db小鼠腎小球中表達下降
　　1.1.2型糖尿病小鼠的尿蛋白水平
　　與同周齡的對照組db/m小鼠（8周：5037.34±1037.73μg/24h；12周：2649.32±87.07μg/24h；16周：34605.02±16160.58μg/24h）相比，db/db小鼠在第8周（4777.18±1378.49μg/24h）時尿蛋白水平?jīng)]有明顯的變化，但隨著周齡的增加，在第12周（18629.52±3885.96μg

9、/24h，P＜0.01）和第16周（323798.60±67766.10μg/24h，P＜0.01）尿蛋白水平逐漸增高，顯著高于對照組。
　　1.2.KLF4在腎小球中的表達水平
　　PCR的結(jié)果顯示，與對照組db/m小鼠相比， db/db小鼠腎皮質(zhì)中KLF4的mRNA表達水平顯著下降。Western blot的結(jié)果顯示，與對照組db/m小鼠相比，db/db小鼠腎皮質(zhì)中KLF4蛋白表達水平顯著下降。免疫組化的結(jié)果顯示，與對照

10、組db/m小鼠（275.50±30.26）相比，db/db小鼠（150.25±15.97，P＜0.01）腎小球中KLF4表達水平顯著下降。
　　以上結(jié)果提示，腎小球KLF4表達下降可能與2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生有關。
　　2.腎小球過表達KLF4后，db/db小鼠的尿蛋白水平顯著降低
　　2.1.KLF4在腎小球中的表達水平
　　免疫組化的結(jié)果顯示，與無過表達KLF4的db/db小鼠（152.25±12.89）

11、相比，過表達KLF4的db/db小鼠腎小球中KLF4表達水平（317.5±33.25，P＜0.01）顯著上調(diào)。
　　2.2.腎小球過表達KLF4后，db/db小鼠的尿蛋白水平
　　過表達KLF4后，db/db小鼠尿蛋白水平（264330.80±33824.15μg/24h， P＜0.05）較無過表達KLF4的對照組（435255.6±10446.17μg/24h）明顯降低。
　　以上結(jié)果說明，腎小球KLF4表達下降，是

12、2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的原因之一，增加KLF4的表達能夠改善2型糖尿病腎病尿蛋白。
　　3.KLF4可通過增加db/db小鼠腎小球中nephrin、integrinβ1和α-actin4的表達來改善2型糖尿病腎病的尿蛋白水平
　　3.1.2型糖尿病小鼠腎小球的結(jié)構
　　PAS染色結(jié)果顯示db/db小鼠與對照組db/m小鼠的腎小球結(jié)構沒有明顯差異。
　　3.2.腎小球蛋白濾過屏障關鍵蛋白， nephrin、int

13、egrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP的表達水平
　　免疫組化的結(jié)果顯示，除CD2AP和integrinα3外，db/db小鼠腎小球中nephrin（0.148±0.003，P＜0.01）、integrinβ1（0.109±0.009，P＜0.05）和α-actin4（0.136±0.001，P＜0.05）的表達水平均顯著低于對照組db/m小鼠（nephrin：0.208±0.016；integrinβ

14、1：0.180±0.008；α-actin4：0.159±0.007）；當db/db小鼠過表達KLF4后，腎小球中nephrin（0.178±0.006， P＜0.01）、integrinβ1（0.164±0.006，P＜0.01）和α-actin4（0.156±0.006， P＜0.05）的表達水平顯著高于無過表達KLF4的db/db小鼠（nephrin：0.148±0.003；integrinβ1：0.109±0.009；α-act

15、in4：0.136±0.001）。
　　與文獻報道相符，integrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP在腎小管中也有表達。與對照組db/m小鼠相比，db/db小鼠腎小管中α-actin4的表達較低，integrinβ1、integrinα3、和CD2AP的表達無明顯的差異；db/db小鼠過表達KLF4后，腎小管中integrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP的表達無明顯的變化。n

16、ephrin特異性表達在腎小球中，但在本實驗中，在腎小管中也有少量陽性顆粒，可能是因為實驗條件不夠優(yōu)化所致。
　　以上結(jié)果說明，2型糖尿病小鼠腎小球中nephrin、integrinβ1和α-actin4的表達水平與KLF4的表達水平有關，低表達水平的KLF4有可能通過影響nephrin、integrinβ1和α-actin4的表達下降而與2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生相關聯(lián)。另外，2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生可能還與腎小管中α-act

17、in4的表達下降有關。
　　4.在高脂環(huán)境的足細胞中，KLF4可以調(diào)節(jié)nephrin、integrinβ1的表達
　　在不同濃度的C16:0環(huán)境下，足細胞中KLF4呈濃度依賴性下降。并且發(fā)現(xiàn)，足細胞在C16:0濃度為250μM的高脂環(huán)境中48小時后，伴隨著KLF4的下降， nephrin和integrinβ1蛋白表達水平均顯著下降，而α-actin4的蛋白表達水平?jīng)]有明顯的變化；對高脂環(huán)境的足細胞過表達KLF4后，nephr

18、in的mRNA和蛋白表達水平顯著升高；integrinβ1的mRNA表達水平無明顯的變化，蛋白表達水平顯著升高。此結(jié)果說明，在高脂環(huán)境的足細胞中，KLF4很可能從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)了nephrin的表達，進而上調(diào)了蛋白的表達；從尚未知的途徑只影響了integrinβ1的蛋白表達。
　　以上結(jié)果說明，2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生與KLF4表達減少有關。其可能機制：（1）與足細胞中低水平KLF4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)nephrin的表達下降有關；（2）與足