類泛素化修飾抑制劑MLN4924通過阻止BRCA1復(fù)合體募集抑制DNA雙鏈斷裂修復(fù).pdf

1、DNA雙鏈斷裂是DNA損傷最嚴(yán)重的形式，對(duì)此，細(xì)胞主要通過兩種修復(fù)途徑來應(yīng)對(duì)：非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重組（homologous recombination,HR）。細(xì)胞選擇NHEJ途徑進(jìn)行修復(fù)時(shí)不需要模板，所以在細(xì)胞周期全過程都可以發(fā)生，在G1期尤為顯著，是一種錯(cuò)誤傾向性修復(fù)；HR修復(fù)過程需要同源的姐妹染色單體為模板合成新的DNA鏈，因此只有處于S期和G2期的細(xì)胞才有可能通

2、過此途徑進(jìn)行修復(fù)，是一種無錯(cuò)修復(fù)方式。
　　乳腺癌相關(guān)基因1（breast cancer associated gene1，BRCA1）是HR修復(fù)通路中的重要蛋白，它除了能夠修復(fù)損傷的DNA外，還可以激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，是一種關(guān)鍵的抑癌基因。
　　據(jù)之前報(bào)道，類泛素化（Neddylation）反應(yīng)可以調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)過程，并且可能通過影響B(tài)RCA1來發(fā)揮作用。為了更深入研究Neddylation對(duì)BRCA1的影響，我們?cè)诒?/p>

3、研究中使用了MLN4924這個(gè)小分子抑制劑。MLN4924是一種有效且特異的NEDD8的小分子抑制劑，它能夠與NEDD8活化酶形成復(fù)合物，進(jìn)而有效且特異地抑制NEDD8對(duì)目的蛋白的修飾。
　　考慮到NEDD8是一種類泛素，它可能會(huì)通過修飾BRCA1蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)同源重組修復(fù)通路。于是我們首先通過Pull-down實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證此假設(shè)，結(jié)果顯示NEDD8并不能修飾BRCA1，但這并不代表對(duì)BRCA1沒有影響。接著我們用Neddylati

4、on活化酶抑制劑MLN4924特異性抑制Neddylation反應(yīng)，探討Neddylation對(duì)BRCA1復(fù)合體的影響。結(jié)果顯示Neddylation反應(yīng)被抑制以后， BRCA1復(fù)合體中的蛋白組分，包括RAP80、BARD1以及BRCA1在DNA斷裂位點(diǎn)的募集明顯被抑制，這說明MLN4924對(duì)DNA的同源重組修復(fù)通路產(chǎn)生影響。同樣PARP的抑制劑也能抑制同源重組修復(fù)，于是我們考慮MLN4924可能與PARP的抑制劑Olaparib協(xié)同作

5、用來抑制DNA的同源重組修復(fù)，進(jìn)而抑制DNA受損的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。為驗(yàn)證這一設(shè)想，我們聯(lián)合MLN4924與Olaparib預(yù)處理A549和H1299兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，然后通過細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)（cell counting kit-8,CCK8）檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖，結(jié)果如我們所預(yù)料，兩者聯(lián)合用藥相比單獨(dú)用藥更有效地抑制了這兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)。進(jìn)一步我們通過檢測(cè)DNA雙鏈斷裂分子標(biāo)志物γH2AX，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合用藥處理細(xì)胞后，

6、細(xì)胞內(nèi)γH2AX增加的量以及殘留時(shí)間相比單獨(dú)用藥或者不用藥處理時(shí)都有顯著增加，說明實(shí)驗(yàn)組中DNA的修復(fù)過程被嚴(yán)重抑制。最后我們用Kaplan-Meier繪制出肺癌病人的預(yù)后情況與NEDD8、PARPs、BRCA1三者的表達(dá)量的關(guān)系，結(jié)果呈負(fù)相關(guān)性。這些現(xiàn)象提示我們MLN4924與Olaparib聯(lián)合用藥可能會(huì)成為治療非小細(xì)胞肺癌的新策略。
　　目的：
　　1.利用MLN4924特異性抑制Neddylation反應(yīng)，檢測(cè)經(jīng)IR

7、處理后人骨肉瘤細(xì)胞中BRCA1復(fù)合體部分組分蛋白在DNA損傷位點(diǎn)的募集情況，進(jìn)而探討Neddyaltion修飾對(duì)BRCA1復(fù)合體的影響；
　　2.MLN4924和Olaparib聯(lián)合處理A549和H1299，觀察聯(lián)合用藥對(duì)兩種細(xì)胞系增殖的影響，進(jìn)而探討兩者聯(lián)合用藥治療非小細(xì)胞肺癌的可能性；
　　3.通過檢測(cè)γH2AX的量及其在細(xì)胞中存在的時(shí)間長(zhǎng)短來確定MLN4924與Olaparib聯(lián)合用藥會(huì)更大程度地影響DNA修復(fù)，進(jìn)而使

8、細(xì)胞生長(zhǎng)受到更顯著的抑制；
　　4.用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫來宏觀地判斷NEDD8、PARPs、BRCA1三者表達(dá)量與肺癌病人預(yù)后情況的關(guān)系。
　　方法：
　　分別轉(zhuǎn)染SFB空載質(zhì)粒（SFB-VEC）、SFB-NEDD8野生型質(zhì)粒（SFB-NEDD8 WT）以及SFB-NEDD8突變型質(zhì)粒（SFB-NEDD8 Mut）于293T細(xì)胞，24h后，熒光顯微鏡下檢測(cè)有綠色熒光，然后進(jìn)行10Gy照射，收集照射后1h的細(xì)

9、胞，做Pull-down實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NEDD8是否修飾BRCA1蛋白；用終濃度為3μM的MLN4924預(yù)處理U2OS細(xì)胞1h，8Gy照射，免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)照射后6h細(xì)胞內(nèi)BRCA1的焦點(diǎn)；以Lipofectamin2000為轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染GFP-BARD1和GFP-XRCC1兩種質(zhì)粒到U2OS細(xì)胞，24h后利用激光微照射方法對(duì)DNA造成損傷，熒光顯微鏡下觀察GFP熒光強(qiáng)度并拍照；用終濃度為3μM的 MLN4924預(yù)處理U2OS細(xì)胞1h

10、，照射（8Gy），然后依次收集照射后1、2、4、8和12h的細(xì)胞沉淀，用0.2M HCL提取細(xì)胞染色體組分蛋白，以Lamin-C為內(nèi)參，通過免疫印跡法檢測(cè)募集到染色體上的RAP80的變化；用梯度濃度（0.01μM-10μM）的MLN4924和Olaparib分別處理A549和H1299兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，然后通過細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種細(xì)胞系的生殖情況，選擇細(xì)胞半數(shù)致死時(shí)對(duì)應(yīng)的藥物濃度作為后續(xù)研究的用藥濃度，然后兩種藥物聯(lián)合用藥，

11、再次利用細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的增殖的影響；終濃度為0.1μM的Olaparib和0.1μM的MLN4924分別或者聯(lián)合用藥預(yù)處理A549和H1299兩種細(xì)胞系1h，2Gy照射，24h后收集細(xì)胞，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)γH2AX，根據(jù)γH2AX的量及其在細(xì)胞內(nèi)存在的時(shí)間長(zhǎng)短來判斷DNA的修復(fù)情況；利用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫說明肺癌病人的預(yù)后情況與NEDD8、BRCA1、PARPs三者在體內(nèi)表達(dá)量的關(guān)

12、系。
　　結(jié)果：
　　1.Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NEDD8不能修飾BRCA1蛋白；
　　2.抑制Neddylation修飾后，BRCA1以及BRCA1-A復(fù)合體中的BRAD1和RAP80蛋白在DNA斷裂末端的募集相比對(duì)照組受到明顯的抑制；
　　3.細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，類泛素抑制劑MLN4924與PARP1抑制劑Olaparib聯(lián)合用藥協(xié)同抑制A549和H1299兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的增殖

13、；
　　4.激光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示，照射后24h在用MLN4924和Olaparib聯(lián)合用藥預(yù)處理的細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂分子標(biāo)志物γH2AX仍然存在，而在單獨(dú)用藥或者不用藥處理組中γH2AX幾乎全部消失，說明在聯(lián)合用藥處理的細(xì)胞中， DNA損傷修復(fù)過程被強(qiáng)烈地抑制；
　　5.Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫分析顯示，在肺癌病人中NEDD8、PARPs、BRCA1三者的表達(dá)量與患者的預(yù)后情況成負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1

14、.NEDD8不是通過直接修飾BRCA1蛋白來調(diào)節(jié)同源重組修復(fù)的，但是當(dāng)Neddylation反應(yīng)被抑制后電離輻射引起的BRCA1、BARD1以及RAP80在DNA斷裂末端的募集被明顯抑制；
　　2.MLN4924和Olaparib兩者聯(lián)合用藥能夠嚴(yán)重阻礙DNA修復(fù)進(jìn)程，進(jìn)而協(xié)同抑制了A549和H1299兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的增殖；
　　3.NEDD8、BRCA1、PARPs基因的高表達(dá)與肺癌病人的不良預(yù)后密切相關(guān)，這提示M