自噬在高糖高脂對H9c2心肌細胞凋亡中的影響.pdf

1、目的：
　　自噬在糖尿病心肌病損傷中的作用至今不詳。本實驗采用高糖高脂誘導H9c2心肌細胞，建立糖尿病心肌病心肌肥大模型，觀察高糖高脂對細胞損傷包括細胞凋亡的影響；探究自噬在高糖高脂誘導心肌細胞肥大中對H9c2心肌細胞凋亡的影響。
　　方法：
　　實驗分三部分：（1）采用隨機數(shù)表法將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細胞隨機分組：對照組、不同濃度高糖高脂（250μM、500μM、1000μM）分別干預H9c2心肌細胞不同時間組（1

2、2 h、24 h、36 h、48 h），進行HE染色，通過測量心肌細胞表面積的方法觀察高糖高脂對H9c2心肌細胞肥大的影響；RT-PCR法檢測心肌肥大標記基因ANP和α-SKA表達水平；（2）采用隨機數(shù)表法將H9c2心肌細胞進行分組（同第一部分），運用乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測方法評估細胞損傷程度；運用流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）檢測細胞活性和凋亡率；（3）結合以上實驗結果，采用隨機數(shù)表法將體外培養(yǎng)的H9c2心

3、肌細胞隨機分組：對照組、500μM高糖高脂干預H9c2心肌細胞36 h組（HGHL組）、自噬抑制劑氯喹預處理高糖高脂干預組(CQ+HGHL組），應用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測自噬標志蛋白LC3 II和細胞凋亡標志蛋白cleaved csapase-3表達水平，觀察自噬在糖尿病心肌病心肌細胞肥大中對細胞凋亡的影響；應用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測對照組以及高糖高脂干預組（500μM組）自噬指標LC3

4、II以及自噬信號通路p62/SQSTM1（p62）、Beclin-1、溶酶體相關膜蛋白LAMP1、LAMP2蛋白表達水平，探究自噬流在高糖高脂對心肌細胞凋亡中的影響。
　　結果：
　　1.高糖高脂處理可顯著誘導H9c2心肌細胞肥大，呈濃度和時間依賴性。與對照組相比，HGHL（500μM）處理36 h時細胞表面積顯著增加（P<0.05），同時心肌肥大標記基因ANP、α-SKA表達顯著增加（P<0.01）。
　　2.高糖高

5、脂處理可損傷心肌細胞，導致細胞損傷程度、細胞凋亡率均明顯增加，呈濃度和時間依賴性，HGHL（500μM）干預36 h時細胞凋亡率約50％（P<0.05）。
　　3.自噬流在高糖高脂誘導心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，與對照組相比，高糖高脂干預組（HGHL組）cleaved csapase-3蛋白表達水平增加（P<0.05），而使用自噬抑制劑氯喹預處理心肌細胞1 h后，與對照組及高糖高脂組（HGHL組）相比，氯喹預處理組（CQ+HGHL

6、組）細胞凋亡率顯著增加（P<0.05）；自噬流水平在高糖高脂干預下發(fā)生顯著變化，與對照組相比，高糖高脂干預組（500μM組）LC3 II蛋白表達顯著增加（P<0.01），Beclin-1、LAMP1、LAMP2蛋白表達顯著下降（P<0.05），而p62蛋白水平顯著升高（P<0.01）。
　　結論：
　　1.高糖高脂誘導H9c2心肌細胞肥大具有一定時間及濃度依賴性，提示高糖高脂在誘導糖尿病性心肌病心肌損傷及發(fā)病和疾病進展過程中