白細胞介素37對天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞免疫抑制活性的影響及其機制研究.pdf

1、天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)對于維持適度的免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。CD4+CD25+ Treg細胞結(jié)構(gòu)性表達叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)和細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原(CTLA)-4。上述關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)性分子缺陷時，小鼠表現(xiàn)為致死性淋巴細胞增殖表型。CD4+CD25+Treg表達Toll樣受體4(TLR4)，后者可以被脂多糖(LPS)激活，Treg細胞抑制活性隨之增強。Treg細胞還可以分泌抑制性細胞因子，如

2、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β和白細胞介素(IL)-10，發(fā)揮免疫抑制效應，抑制效應T細胞。Treg細胞自身增殖活性低下，它在體外可以抑制IL-2的產(chǎn)生，進而抑制T細胞活化。Treg細胞還可以通過細胞表面的IL-2受體，消耗效應T細胞賴以生存的IL-2，進而導致效應T細胞凋亡。Treg細胞可以控制Th1和Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子表達，進而控制Th1和Th2型免疫反應。Treg細胞對于控制膿毒癥早期的炎癥反應有利。但是Treg細胞增多可以導致淋巴細

3、胞增殖受抑制，進而導致膿毒癥免疫麻痹。
　　IL-37(IL-1F7)在人類細胞表達，在小鼠中不表達。但是人重組IL-37對小鼠細胞的效應和人類細胞的效應相似，均表現(xiàn)為下調(diào)固有免疫和獲得性免疫反應。體內(nèi)研究顯示，IL-37在多種炎癥疾病中發(fā)揮抗炎效應。IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示，IL-37對內(nèi)毒素血癥、刀豆素A誘導的肝炎、葡聚糖硫酸鈉誘導的結(jié)腸炎、缺血再灌注損傷均有抗炎保護效應。新近研究顯示，IL-37在人Treg細胞表達，基因

4、敲減IL-37可以減弱Treg細胞的抑制活性。
　　研究目的：
　　1.研究IL-37對正常小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影響;
　　2.體外模擬膿毒癥環(huán)境，研究IL-37對LPS環(huán)境中小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影響;
　　3.研究IL-37對膿毒癥小鼠的生存保護效應。
　　研究方法：
　　1.按照說明書要求，用美天妮磁性分離儀從C57BL/6J小鼠脾臟細胞中分選CD4

5、+CD25+Treg細胞和CD4+CD25-T細胞。流式細胞術(shù)鑒定CD4+CD25+Treg純度;
　　2.用重組人IL-37(rhIL-37)(0～250ng/ml)刺激Treg細胞12～48h。收集細胞上清液，EHSA分析Treg細胞分泌IL-10和TGF-β1變化;部分預處理的Treg細胞，進行免疫熒光染色，流式細胞術(shù)分析Treg細胞CTLA-4和Foxp3表達變化;部分預處理的Treg細胞用于抑制活性分析。IL-37預處理

6、的Treg細胞與CFSE標記的CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)，96小時后收集上清液，ELISA檢測CD4+CD25-T細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ濃度。同時收集細胞，上流式細胞儀檢測CFSE稀釋度，檢測發(fā)生CFSE稀釋的CD4+CD25-T細胞百分比，借此分析CD4+CD25-T淋巴細胞增殖程度。通過檢測上述指標，分析IL-37刺激和Treg細胞免疫抑制活性之間的關(guān)系，
　　3.LPS(5μg/ml)預處理Treg細胞3

7、天，預處理結(jié)束前24h向培養(yǎng)基中加入不同濃度IL-37(0～250ng/ml)。預處理完畢后分析Treg細胞Foxp3/CTLA-4表達，IL-10/TGF-β分泌;Treg/CD4+CD25-T共培養(yǎng)，收集細胞上流式細胞儀，檢測Treg對效應T細胞增殖活性的抑制程度;收集共培養(yǎng)上清液，檢測IL-2、IL-4和IFN-γ分泌。通過分析上述指標，明確LPS環(huán)境中，IL-37能否影響Treg細胞免疫抑制活性。
　　4.建立小鼠盲腸結(jié)扎

8、穿孔(CLP)模型，假手術(shù)組只分離盲腸，但不予結(jié)扎穿刺。給小鼠腹腔注射IL-37（1μg）。IL-37腹腔注射分三種方式:CLP術(shù)前2h注射、CLP術(shù)后立即注射和CLP術(shù)后2h注射。在三個相應時間點腹腔注射PBS(200μl)作為對照組處理方式。處理完畢后，觀察CLP小鼠8天生存率。
　　5.統(tǒng)計學分析:應用SPSS軟件統(tǒng)計分析。連續(xù)性變量首先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(SD)表示。每個實驗重復三次。多組比較

9、應用單因素方差分析和Bonferroni檢驗。生存率應用Kaplan-Meier生存曲線分析和log rank檢驗。P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。
　　研究結(jié)果：
　　1.IL-37對CD4+CD25+Treg抑制活性的影響:IL-37預處理增強了CD4+CD25+Treg細胞對效應T細胞的免疫抑制活性，100 ng/ml處理組和24h處理組效應最明顯。LPS可以活化小鼠Treg細胞，加強Treg細胞免疫抑制活性。IL-37

10、預處理，可以進一步上調(diào)LPS環(huán)境中的Treg細胞的免疫抑制活性。
　　2.IL-37對Treg細胞Foxp3/CTLA-4表達的影響:IL-37(40～250ng/ml)預處理Treg細胞24h，可以顯著增強Foxp3表達;IL-37(100～250ng/ml)預處理Treg細胞24h，可以顯著增強CTLA-4表達。100 ng/mlIL-37預處理Treg細胞不同時間，24h組Treg細胞的Foxp3/CTLA-4表達上調(diào)最明顯

11、。LPS刺激上調(diào)Foxp3表達，但是對CTLA-4表達無影響。IL-37聯(lián)合LPS刺激，可以上調(diào)Treg細胞Foxp3/CTLA-4表達。
　　3.IL-37對Treg細胞IL-10/TGF-β分泌的影響:IL-37促進Treg細胞分泌TGF-β1。LPS刺激也可以加強TGF-β1分泌。LPS環(huán)境中，IL-37刺激可以進一步促進Treg細胞分泌TGF-β。IL-37和LPS單獨刺激，或IL-37/LPS聯(lián)合刺激，對Treg細胞IL

12、-10分泌均無影響。
　　4.IL-37對共培養(yǎng)試驗中CD4+CD25-T細胞分泌IL-2、IL-4和IFN-γ的影響:Treg細胞可以抑制IL-2，但是IL-37預處理不影響Treg對IL-2的抑制效應。LPS預處理加強Treg細胞對IL-2的抑制效應，LPS聯(lián)合IL-37刺激，不能進一步上調(diào)Treg細胞對IL-2的抑制效應。Treg細胞有效誘導Th2細胞極化，共培養(yǎng)試驗中上清液IL-4/IFN-γ比例增加，提示Th2細胞增多。