雙酯型烏頭堿致心肌細(xì)胞自發(fā)性鈣釋放機(jī)制研究.pdf

1、附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根加工品。在臨床使用中，附子被廣泛應(yīng)用于治療心力衰竭、急性心肌梗死、休克、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、關(guān)節(jié)炎等疾病，取得了良好療效。在基礎(chǔ)研究方面，根據(jù)對(duì)附子中次生代謝產(chǎn)物研究表明其主要有生物堿、附子脂酸、脂肪酸酯等成分。其中，生物堿類主要包括新烏頭堿(mesaconitine，MAC)、烏頭堿(aconitine，AC)、次烏頭堿(hypaconiti

2、ne，HAC)、去甲烏藥堿(higenamine)、烏頭原堿等。在臨床廣泛應(yīng)用與治療各種疾病的同時(shí)，附子也因其毒性在臨床應(yīng)用中受到較大限制。現(xiàn)代研究則提出，附子的主要活性成分烏頭類生物堿既是附子的藥效成分，也是主要的毒性成分。烏頭類生物堿尤其是雙酯型二萜類生物堿，如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等的毒性較大。
　　上述三種雙酯型烏頭堿在以往研究中以烏頭堿報(bào)道最多。烏頭堿毒性主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，對(duì)心臟的毒性最為明顯。在心

3、臟上可出現(xiàn)多形性心律失常，如單源室性早搏、單源多形室性早搏、室速及室顫，病人常因心律失常及呼吸中樞麻痹死亡。烏頭堿能夠影響電壓依賴性鈉通道，在去極化過程中抑制鈉通道構(gòu)象改變，使得鈉通道維持激活狀態(tài)，膜電位持續(xù)去極化。但烏頭堿所致的心律失常不能單純用促進(jìn)Na+電流內(nèi)流來解釋。觸發(fā)活動(dòng)(TA)是一種重要的心律失常誘發(fā)機(jī)制，因?yàn)槠渑c自主性相關(guān)的自發(fā)去極化有關(guān)，包括早期后去極化(EAD)和延遲后去極化(DAD)。DADs不但可引發(fā)觸發(fā)沖動(dòng)，其也

4、可直接導(dǎo)致自主性的心律失常。人們認(rèn)為遲后除極(DADs)是在胞內(nèi)Ca2+的積累狀態(tài)下由肌漿網(wǎng)自發(fā)釋放出Ca2+形成的。當(dāng)前研究認(rèn)為烏頭堿致心率失常主要通過Nac-NCX途徑:烏頭堿導(dǎo)致鈉通道(Na+ channel，NaC)開放時(shí)間增加，鈉離子持續(xù)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度增加，通過鈉鈣交換體(Na+/Ca2+ exchanger，NCX)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而誘發(fā)心律失常;肌漿網(wǎng)的鈣釋放過程中，過量

5、的Ca2+也會(huì)通過NCX貢獻(xiàn)了胞內(nèi)Na+的去極化活動(dòng)。如果內(nèi)流的Na+足夠產(chǎn)生DAD振幅的話，從而誘發(fā)一次新的細(xì)胞膜去極化。烏頭堿對(duì)上述NaC-NCX途徑結(jié)果，可以使動(dòng)作電位時(shí)程(action potentialduration，APD)延長，進(jìn)而出現(xiàn)遲后除極和觸發(fā)活動(dòng)。
　　在臨床應(yīng)用中，單純的阻斷鈉通道僅能部分抑制心室動(dòng)過速，有報(bào)道提出使用鈣通道拮抗劑在藥效上優(yōu)于使用鈉通道拮抗劑。在興奮收縮耦聯(lián)(excitation-cont

6、raction coupling，ECC)過程中，細(xì)胞膜去極化引起L型鈣通道開放，使外鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過一種以鈣致鈣(calcium-induced calcium release，CICR)的方式激活RyR2將肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣大量釋放。當(dāng)胞內(nèi)鈣離子過度增加時(shí)，造成鈣超載，誘發(fā)鈣波的頻率增加，從而引起心率失常。有報(bào)道指出烏頭堿誘導(dǎo)的心率失常可能跟RyR2的激活有直接的關(guān)系。最近的報(bào)道指出，烏頭堿能夠下調(diào)SERCA的蛋白表達(dá)，其可能使細(xì)胞在興奮

7、收縮耦聯(lián)中不能及時(shí)消除胞漿內(nèi)的鈣離子而造成胞質(zhì)內(nèi)的鈣聚集從而導(dǎo)致RyR開放頻率增加，或者在肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣含量增高時(shí)，RyR對(duì)鈣離子的敏感性增加導(dǎo)致肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)鈣泄漏(calcium leak)增大，從而更容易誘發(fā)不節(jié)律鈣釋放。烏頭堿通過多種途徑能夠引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加可能是出現(xiàn)心律失常的一個(gè)原因，或使細(xì)胞RyR2對(duì)鈣敏感性增加，更容易觸發(fā)鈣自肌漿網(wǎng)內(nèi)釋放，但這一結(jié)論尚無直接的證據(jù)證明。

8、　　綜上，本研究考察三種雙酯型烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞鈣釋放的影響，分別從毒性作用即誘導(dǎo)細(xì)胞自發(fā)性鈣釋放(spontaneous calcium release，SCR)、鈣瞬變以及正性肌力作用角度考察藥物的效應(yīng)。探尋烏頭堿導(dǎo)致自發(fā)性鈣釋放與升高細(xì)胞內(nèi)鈣、肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣含量、肌漿網(wǎng)鈣泄漏以及興奮收縮耦聯(lián)中SERCA和NCX的功能變化的關(guān)系，研究鈣穩(wěn)態(tài)失衡的機(jī)制，闡述烏頭堿的毒性機(jī)理。通過阻斷鈉通道、鈣通道、鈉鈣交換體以及腎上腺素能受體，檢測能夠有效

9、消除烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞自發(fā)性鈣釋放的干預(yù)方式，從鈣轉(zhuǎn)運(yùn)角度闡述鈣穩(wěn)態(tài)失衡對(duì)心律失常的影響。
　　同時(shí)本研究亦篩選具有潛在消除烏頭堿心臟毒性的中藥組分，主要包括已報(bào)道具有阻斷上述離子通道或受體作用的中藥單體或配伍組分。以期找到能夠有效消除烏頭堿致自發(fā)性鈣釋放的中藥組分，為臨床增效或減毒應(yīng)用提供依據(jù)。
　　第一部分三種雙酯型烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞鈣釋放研究
　　目的:研究三種雙酯型烏頭堿（烏頭堿，新烏頭堿，次烏頭堿）對(duì)心肌細(xì)胞鈣釋

10、放的毒效關(guān)系，包括心肌細(xì)胞自發(fā)性鈣釋放的誘發(fā)率、舒張末期鈣濃度(F0)、鈣瞬變幅度(ΔF)以及收縮功能的研究。
　　方法:急性分離成年SD大鼠左心室肌細(xì)胞，分別使用0.3μmol·L-1，1μmol·L-1，3μ mol·L-1的上述三種雙酯型烏頭堿灌流細(xì)胞12分鐘，檢測持續(xù)搏動(dòng)細(xì)胞在灌流4min、8min、12min時(shí)間點(diǎn)隨時(shí)間依賴性及濃度依賴性SCR誘發(fā)率及對(duì)細(xì)胞F0、ΔF的變化。檢測0.3μmol·L-1上述三種藥物在12

11、min發(fā)揮正性肌力作用時(shí)鈣瞬變和收縮功能動(dòng)力學(xué)的同步變化，分析其毒性和藥效作用關(guān)系。
　　結(jié)果:三種雙酯型烏頭堿均能誘發(fā)心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性鈣釋放，其中在低濃度(0.3μmol·L-1)時(shí)新烏頭堿即引起較高的誘發(fā)率，但高濃度（3μmol·L-1）時(shí)烏頭堿的誘發(fā)率能達(dá)到三者最大。三種烏頭堿也能夠濃度依賴性增加舒張末期鈣濃度及鈣瞬變幅度，新烏頭堿效應(yīng)最強(qiáng)，次烏頭堿效應(yīng)最弱。三種烏頭堿在低濃度（0.3μmol·L-1）時(shí)均能增加心肌收縮力

12、及鈣瞬變幅度和速率，尤其對(duì)舒張期的功能提高更明顯。
　　結(jié)論:三種雙酯型烏頭堿的正性肌力作用與產(chǎn)生自發(fā)性鈣釋放毒性效應(yīng)同時(shí)存在，表明藥物作用于心肌細(xì)胞是毒效并存，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高是產(chǎn)生正性肌力作用的有利因素但同時(shí)也是誘發(fā)自發(fā)性鈣釋放的危險(xiǎn)因素。
　　第二部分烏頭堿對(duì)心肌興奮收縮耦聯(lián)毒性機(jī)制研究及干預(yù)
　　目的:檢測烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)過程中鈣轉(zhuǎn)運(yùn)影響;檢測干擾觸發(fā)活動(dòng)中關(guān)鍵離子通道和受體對(duì)烏頭堿誘發(fā)自發(fā)性鈣釋放

13、影響。
　　方法:急性分離成年SD大鼠左心室肌細(xì)胞，研究0.3μmol·L-1濃度下12min時(shí)烏頭堿對(duì)持續(xù)搏動(dòng)狀態(tài)下心肌細(xì)胞內(nèi)鈣，鈣瞬變，SERCA和NCX功能、肌漿網(wǎng)鈣容量及鈣泄漏影響。分析鈉通道、鈣通道、鈉鈣交換體、腎上腺素能受體阻斷下1 mol·L-1烏頭堿在12min時(shí)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞SCR發(fā)生率、舒張末期鈣濃度(F0)、鈣瞬變幅度(ΔF)的變化。
　　結(jié)果:烏頭堿能夠加快心肌細(xì)胞舒張期的鈣消除速率，同時(shí)增強(qiáng)SERCA

14、和NCX的活性并增加肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣容量并造成肌漿網(wǎng)鈣泄漏水平增加。顯著增加鈣瞬變過程中鈣從肌漿網(wǎng)釋放占肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量的比例。烏頭堿主要通過NaC-NCX途徑增加鈣離子濃度并誘發(fā)自發(fā)性鈣釋放。利多卡因、KB-R7943及其聯(lián)合應(yīng)用下，烏頭堿誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞舒張期鈣濃度、自發(fā)性鈣釋放發(fā)生率均發(fā)生下降且三者之間無顯著性差異。利多卡因能夠明顯降低鈣瞬變幅度但仍高于正常細(xì)胞。硝苯地平能夠降低SCR發(fā)生率同時(shí)大幅降低鈣瞬變幅度。L-型鈣通道貢獻(xiàn)了鈣自發(fā)

15、性釋放過程，但并非主導(dǎo)因素。腎上腺素能受體介導(dǎo)的信號(hào)通路參與了烏頭堿調(diào)控NaC-NCX之外的調(diào)節(jié)。阻斷腎上腺素能受體能夠有效消除烏頭堿致SCR發(fā)生率。聯(lián)合應(yīng)用AR阻斷劑和鈉通道阻滯劑能夠達(dá)到消除SCR最佳效果。
　　結(jié)論:烏頭堿能夠引起心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，使肌漿網(wǎng)鈣庫容量增高，鈣泄漏增加。阻斷鈉通道和腎上腺素能受體能夠有效消除烏頭堿導(dǎo)致的自發(fā)性鈣釋放。第三部分中藥組分與烏頭堿配伍增效減毒作用
　　目的:篩選具有消除烏頭堿致自

16、發(fā)性鈣釋放的中藥組分，為臨床增效或減毒應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:急性分離成年SD大鼠左心室肌細(xì)胞，研究在不同中藥組分的干預(yù)下0.3μmol·L-1烏頭堿12min時(shí)對(duì)持續(xù)搏動(dòng)狀態(tài)下心肌細(xì)胞SCR發(fā)生率、舒張末期鈣濃度(F0)、鈣瞬變幅度(ΔF)的影響變化。中藥組分主要來自于以往報(bào)道具有鈉通道、鈣通道、鈉鈣交換體或者腎上腺素能受體抑制作用的單體或配伍。
　　結(jié)果:篩選的15種中藥單體在10uM濃度時(shí)均未能有效消除烏頭堿導(dǎo)致的自