Notch信號通路對心肌梗死合并糖尿病大鼠的心肌保護作用及機制研究.pdf

1、心肌梗死是冠心病中的急危重癥，冠狀動脈內粥樣斑塊通常不穩(wěn)定極易破潰，從而引起出血，并且形成血栓，進一步管腔閉塞。通?；加行募」Ｋ赖幕颊哐懿∽冊街兀渌劳雎试礁?。糖尿病是導致冠心病的一個獨立且重要的危險因素。糖尿病患者患冠心病的風險更高，冠心病合并糖尿病常為多支冠狀動脈血管受累，病變彌漫且廣泛，冠狀動脈內更易形成斑塊和血栓。防治冠心病合并糖尿病現已成為全世界醫(yī)學和社會經濟的巨大挑戰(zhàn)課題之一。
　　目的：
　　Notch信號通

2、路參與細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡、粘附等過程，與心血管疾病密切相關，其通過提高心肌細胞活力、抑制細胞凋亡、防止心室重構以及抑制心肌纖維化，從而發(fā)揮其對心臟的保護作用。在動脈粥樣硬化、心肌梗死和心肌肥厚、心力衰竭模型中發(fā)現Notch信號通路的活性增強。但是以往研究均在非糖尿病模型中進行，關于Notch信號通路在糖尿病并發(fā)癥方面的研究，只局限于糖尿病腎病。目前國內外還沒有關于Notch信號通路在心肌梗死合并糖尿病動物模型中表達的相關研究報道

3、。因此本實驗建立心肌梗死合并糖尿病大鼠模型，檢測Notch信號通路中Notch受體(Notch1、Notch4)、配體(Jagged1、Dll1)及Notch共激活子(Mastermind-like protein1、p300)的表達水平，并且進一步通過體外心肌細胞實驗應用激動劑激活Notch信號通路從而進一步證明該信號通路具有提高心肌梗死合并糖尿病大鼠心肌細胞活力、抑制心肌細胞凋亡，保護心肌的作用，為臨床上心肌梗死合并糖尿病的患者找到

4、新的治療靶點提供實驗理論依據。
　　實驗方法：
　　第一部分:Notch1、Notch4/Jagged1、Dll1/Mastermind-like protein1、p300在心肌梗死合并糖尿病大鼠心肌中的表達水平及其保護作用研究
　　本研究采用SD大鼠進行如下在體動物實驗:
　　1、實驗動物模型的建立:選取6-8周齡健康雄性SD大鼠，體重200-250克。
　　糖尿病組(DM)、糖尿病假手術組（DM-sh

5、am，只進行開胸手術及穿線，但不結扎冠狀動脈）、心肌梗死合并糖尿病組(DM-MI)中的糖尿病大鼠為一次性腹腔注射STZ誘導的糖尿病大鼠動物模型（血糖大于396mmol/L作為建模成功）。對照組（Control）和心肌梗死組(MI)不做處理，心肌梗死組(MI)和心肌梗死合并糖尿病組(DM-MI)大鼠通過開胸結扎冠狀動脈前降支25分鐘，再灌注2小時建立大鼠缺血-再灌注心肌梗死模型。
　　2、實驗分組:將SD大鼠隨機分為以下5組，每組6

6、只。
　　(1)對照組(Control):正常SD大鼠
　　(2)糖尿病組(DM): SD糖尿病大鼠（購買于上海斯萊克實驗動物有限公司）
　　(3)糖尿病假手術組(DM-sham): SD糖尿病大鼠+缺血—再灌注假手術
　　(4)心肌梗死組(MI): SD大鼠+缺血—再灌注手術
　　(5)心肌梗死合并糖尿病組(DM-MI): SD糖尿病大鼠+缺血—再灌注手術
　　3、心肌梗死面積的測定:采用TTC染色

7、方法。
　　4、各實驗組大鼠血清中磷酸肌酸激酶同功酶(CK-MB)和肌鈣蛋白的測定:應用ELISA方法。
　　5、各實驗組大鼠心肌纖維化程度的評價:應用Masson染色方法觀察各組大鼠的心臟病理結果。
　　6、各實驗組大鼠心臟心肌細胞凋亡率的檢測:采用原位末端轉移酶標記染色法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPnick end labeling,TUN

8、EL)。
　　7、各實驗組大鼠心肌中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300 mRNA的表達水平的檢測:采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法。
　　8、各實驗組大鼠心肌中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300蛋白的表達水平的檢測:采用Western blot方法

9、。
　　第二部分:激活Notch信號通路對缺氧合并高糖心肌細胞的保護作用及機制研究
　　本研究在體外培養(yǎng)的H9C2心肌細胞中進行如下實驗:
　　1、實驗分組:
　　(1) H9C2:置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內正常培養(yǎng)H9C2心肌細胞;
　　(2)缺氧組:置于95％N2、5％CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)液正常;
　　(3)高糖組:培養(yǎng)液中加入33mmol/L的葡萄糖置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內培

10、養(yǎng)72h;
　　(4)缺氧+高糖組:培養(yǎng)液中加入33mmol/L的葡萄糖置于95％N2、5％CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng);
　　(5)缺氧+Jagged-1組:將缺氧H9C2細胞在加入5μg/mL Jagged-1的培養(yǎng)液中培養(yǎng);
　　(6)缺氧+高糖+Jagged-1組:同時進行缺氧及33mmol/L的葡萄糖處理，細胞在加入5μg/mL Jagged-1的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　2、各實驗組心肌細胞活力的檢測:采用MTT比

11、色法，觀察心肌細胞存活、生長、增殖的情況。
　　3、各實驗組心肌細胞凋亡的檢測:采用流式細胞技術。
　　4、各實驗組大鼠心肌細胞Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、 Mastermind-likeprotein1和p300 mRNA的表達水平的檢測采用實時熒光定量PCR(Real-timePCR)方法。
　　5、各實驗組大鼠心肌細胞中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Masterm

12、ind-likeprotein1和p300蛋白的表達水平的檢測:采用Western blot方法。
　　結果：
　　1、建立心肌梗死合并糖尿病大鼠動物模型，TTC染色結果顯示:心肌梗死合并糖尿病組大于單純心肌梗死組心肌壞死面積(p＜0.05)。
　　2、各組大鼠心肌組織病理結果顯示:Control組大鼠心肌纖維排列比較緊密，心肌細胞結構清晰，DM-MI大鼠心肌纖維的橫紋丟失，心肌組織溶解，心肌細胞排列紊亂，出現大量藍色

13、膠原纖維組織，成纖維細胞增多。
　　3、在體實驗中各組大鼠心肌細胞凋亡率結果顯示:單純心肌梗死和單純糖尿病大鼠心肌細胞出現大量凋亡，并且心肌梗死合并糖尿病組大鼠心肌細胞凋亡程度明顯加重(p＜0.05)。
　　4、各組大鼠血清CK-MB和TNT結果顯示:單純心肌梗死組大鼠和心肌梗死合并糖尿病大鼠血清中CK-MB和肌鈣蛋白的水平都明顯升高(P＜0.05)。
　　5、各組大鼠心肌組織中Notch1、Notch4、Jagged

14、1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300在mRNA和蛋白水平的表達，結果顯示單純糖尿病大鼠和單純心肌梗死大鼠Notch通路表達均升高(P＜0.05)，而心肌梗死合并糖尿病大鼠Notch通路各指標在mRNA和蛋白水平的表達均呈下降的趨勢(P＜0.05)。
　　6、各組H9C2心肌細胞活力的檢測，結果顯示:缺氧和高糖對心肌細胞H9C2有一定的損傷作用，缺氧合并高糖同時作用時心肌細胞損傷作用更為嚴重(P＜

15、0.05)，當給予Notch通路激活劑Jagged-1后，心肌細胞損傷有所減輕(P＜0.05)，細胞活力有所提高。
　　7、各組H9C2心肌細胞調亡程度的檢測，結果顯示:缺氧和高糖促進H9C2細胞凋亡，并且二者共同作用時凋亡細胞明顯增多(P＜0.05)。在給予Notch信號通路激活劑Jagged-1后，細胞凋亡總趨勢減少(P＜0.05)，但是在早期凋亡和晚期凋亡中有輕微差異。
　　8、各組H9C2心肌細胞Notch1、Not

16、ch4、Jagged1、Dll1在mRNA和蛋白水平上的表達，結果顯示:Notch通路在缺氧和高糖刺激下的H9C2心肌細胞中被激活，而缺氧+高糖同時作用于心肌細胞Notch通路的受體和配體表達明顯降低。
　　結論：
　　1、心肌梗死合并糖尿病大鼠較單純心肌梗死大鼠心肌壞死面積更大、心肌纖維化程度更重、心肌細胞凋亡程度更加嚴重。
　　2、在單純糖尿病和單純心肌梗死大鼠的心肌組織中，Notch受體、配體以及Notch共激活