暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)性腺分化的組織學及芳香化酶基因(CYP19A)表達的研究.pdf

1、性別決定和性別分化在脊椎動物系統(tǒng)發(fā)育史中是兩個重要的過程,高等脊椎動物的性別決定占有重要地位,性別受細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)影響較大。而對于低等脊椎動物,如魚類,其性腺的分化則還受到環(huán)境等多方面的影響。研究魚類性腺的分化規(guī)律對研究脊椎動物進化史和發(fā)育史具有重要的意義。暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形總目、純形目、純科、東方純屬,是我國重要的養(yǎng)殖魚類之一,兼具藥用和食用價值,養(yǎng)殖前景廣泛。本文利用組織學方法

2、,對暗紋東方純性腺進行組織學觀察,對其仔魚發(fā)育過程中,性腺的形態(tài)學變化進行了描述,確定了其性腺分化的關鍵時間節(jié)點。利用分子學手段,對暗紋東方純性腺分化關鍵限速酶的編碼基因CYP19A進行real-time PCR,確定CYP19A在性腺分化過程中的作用。為進一步的研究奠定基礎。
　　 對暗紋東方鲀仔魚性腺分化過程進行組織學切片發(fā)現(xiàn):孵化后11d(11dah,day afterhatching)仔魚膀胱基部與直腸之間的體腔膜上出現(xiàn)

3、原始生殖細胞(Primordial germ cell,PGC),細胞體積大,直徑約7μm,胞質(zhì)著色較淺,核大且透亮,核膜清晰、界限明顯,約占細胞體積的1/2～2/3,核仁偏位,嗜堿性強,被染成藍色;14dah時PGCs增多,緊貼于體腔膜與體細胞(Somatic cells,SC)生成一對組織突起,該結構即為性腺原基(Gonad anlag,GA);29dah性腺原基發(fā)育成為原始性腺(Primary gonads,PG),若干PGCs被

4、SCs包裹,從體腔膜上游離出來。35dah時性腺己出現(xiàn)分化,部分個體出現(xiàn)原始卵巢腔(Ovarian cavity,Oc);而另一部分個體性腺在40dah時觀察到精原細胞(Spermatogonia,Sg),并伴隨有裂隙狀輸精管原基(Spermaduct anlag,Sd)的出現(xiàn)。47dah時原始精小葉和輸精管的形成,且在生殖上皮附近及基質(zhì)中出現(xiàn)了Ⅰ時相卵原細胞,細胞呈圓形,胞質(zhì)較少,嗜堿性,被染成淺紫色。直徑在17～20μm之間,核染色

5、較淺,核徑10～12μm。卵巢與精巢在細胞學上完成分化分別以其性母細胞的出現(xiàn)為標準,時間分別為115dah和81dah,至此,卵巢和精巢才真正完成了分化過程。
　　 芳香化酶(P450arom)是細胞色素P450家族中的一員,在魚類性別分化過程中起到關鍵性作用,可催化雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇。以暗紋東方純二齡魚為實驗材料,根據(jù)已知魚類的CYP19A序列設計兼并引物,利用PCR技術擴增出芳香化酶編碼基因CYP19A的片段,

6、長度為1446bp,發(fā)現(xiàn)與其他物種CYP19A cDNA具有86％以上的同源性,具有較高的保守性。而在與CYP19B進行Spidey比對時,發(fā)現(xiàn)同源性極低。
　　 根據(jù)獲得的CYP19A基因的序列片段設計real-time PCR引物,對不同發(fā)育階段暗紋東方純雌雄魚體內(nèi)的CYP19A基因表達進行real-time PCR發(fā)現(xiàn):雌魚體內(nèi)CYP19A基因表達遠高于雄性,這與CYP19A基因的生理特性有密切關系。在雌魚體內(nèi),CYP19

7、A基因的表達在44dah時出現(xiàn)了高峰。結合組織學研究結果,47dah時,PGC正通過有絲分裂進行增殖,且在生殖上皮附近及基質(zhì)中出現(xiàn)了Ⅰ時相卵原細胞,說明CYP19A的高度表達,產(chǎn)生了大量的芳香化酶,催化雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇,參與性腺結構的構建和卵母細胞的生成和發(fā)育。但是,隨著時間雄性體內(nèi)的CYP19A表達也有逐漸增高的趨勢,可能芳香化酶在雄性發(fā)育過程中也具有某些作用,這還需要在將來的研究中進一步的探討。
　　 通過組