鴨Viperin蛋白抗新城疫病毒機制的初步研究.pdf

1、2001年首次報道Viperin是一種受干擾素、病毒等刺激誘導的基因。近年來，已經(jīng)證實Viperin不僅能被多種因素誘導而大量表達，而且還具有廣譜的抗病毒和抗細菌等作用，甚至還參與調(diào)節(jié)細胞信號通路的功能。由此可見，Viperin在天然免疫中發(fā)揮非常重要的角色。隨著對Viperin的深入和全面研究，逐漸揭示Viperin的抗多種不同病毒、抗細菌等作用機制。本研究從長白鴨的外周淋巴細胞中擴增鴨Viperin基因并利用生物信息學方法對其進行詳

2、盡地基因分析?；赩iperin參與抗病毒作用，通過鴨Viperin蛋白抗NDV的試驗研究，以揭示鴨Viperin抗NDV的分子機制。
　　本研究首先采集鴨抗凝血并分離其外周血淋巴細胞，然后將外周淋巴血細胞提取鴨的總RNA反轉錄成cDNA。根據(jù)已公布的鴨的全基因組中RSAD2序列（登錄號NW_004676922.1以及XM005018580.1）設計相應的擴增引物，最終獲得了鴨Viperin ORF序列。根據(jù)獲得的鴨Viperin

3、基因序列，使用生物信息學軟件對擴增的鴨Viperin序列進行詳盡的功能分析。結果表明，鴨Viperin的蛋白結構與其它已公布物種的Viperin蛋白非常相似，都包括N端區(qū)域、中心區(qū)域和C端區(qū)域。
　　根據(jù)Viperin的基因序列，將Viperin基因克隆到pGEX4T-1原核表達載體，分別利用原核表達方法表達并純化Viperin的融合蛋白。將該融合蛋白免疫1月齡家兔，檢測血清抗體水平，成功制備出兔抗Viperin的血清。早期研究已

4、證實多種病毒可誘導Viperin的表達，于是我們開展鴨Viperin在體內(nèi)體外水平的表達分析。一方面，通過制備并培養(yǎng)鴨的原代胚胎細胞(DEF)，利用不同劑量poly(I:C)和NDV感染DEF后檢測Viperin的表達。結果表明，poly(I:C)和NDV均能刺激誘導Viperin的表達。另一方面，以2周齡長白鴨的為動物材料，使用用NDV感染鴨來檢測Viperin在不同臟器的分布。結果發(fā)現(xiàn)，正常生理情況下，不同臟器的Viperin含量具

5、有較大的差異，Viperin主要分布于血液，其次是肺臟和脾臟，腎臟和肌肉較低;以對照組相比，在NDV感染后，不同臟器Viperin的表達都有不同程度的增加。該結果表明，NDV在細胞水平和鴨體上均能夠增強Viperin表達。
　　為了進一步確定鴨Viperin發(fā)揮抗病毒的關鍵區(qū)域，我們構建了Viperin的缺失片段（包括N端和C端缺失，分別命名為VipΔN和VipΔC）以及設計抑制鴨Viperin表達的siRNA序列。將鴨的Vipe

6、rin基因（Viperin，VipΔN和VipΔC）克隆到pCAGGS真核表達載體上并轉染DEF細胞;利用siRNA技術，轉染siRNA質(zhì)粒于DEF細胞，在轉染后24小時后使用NDV感染DEF，在感染后不同時間內(nèi)收集樣品以檢測NDV的病毒復制情況。結果表明，過表達鴨Viperin的情況下，能顯著的抑制NDV感染，試驗組的NDV滴度明顯低于對照組;轉染siRNA質(zhì)粒后能抑制Viperin的表達，并有利于NDV復制。另外，從過表達鴨VipΔ

7、N和VipΔC結果看，截短體的抗病毒作用已經(jīng)顯著降低，N端缺失后的Viperin還具有有限的抗病毒作用，而C端缺失后則導致Viperin抗病毒作用的完全喪失。這表明，Viperin的C端區(qū)域是其發(fā)揮抗病毒作用的關鍵區(qū)域。
　　綜上所述，本研究研究了鴨Viperin基因的生物特性和探究該蛋白的生物學功能，發(fā)現(xiàn)poly(I:C)和NDV等因素均能誘導Viperin的表達，說明鴨Viperin與其它物種Viperin具有類似的特征;Vi