枯草桿菌蛋白酶的分離純化、酶學性質及體外溶栓性質.pdf

1、隨著我國人口老齡化現(xiàn)象的日益嚴重,老年常發(fā)疾病血栓栓塞性疾病的發(fā)生也極為普遍,這種疾病也是當前致死率很高的病因之一,治療這類疾病的主要手段則是溶栓療法,而纖溶酶主要是催化血栓中的主要成分纖維蛋白水解,從而達到溶解血栓的目的,纖溶酶可來源于動物、植物、微生物,而微生物則是纖溶酶的主要來源,枯草芽孢桿菌是人類最早發(fā)現(xiàn)的細菌,由于它的生長環(huán)境多樣,自身沒有致病性,對高溫、高熱、電磁輻射、紫外線等具有很強抗逆性,它可利用的營養(yǎng)物質多種多樣,且能

2、直接將許多蛋白質分泌到培養(yǎng)基中,產生各種各樣的酶,一直是生物界研究熱點。
　　本文采用單因素實驗對實驗室保存菌種枯草桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化,對發(fā)酵液產生的枯草桿菌蛋白酶進行分離純化,測定了枯草桿菌蛋白酶中具有纖溶活性蛋白酶的部分酶學性質,并研究其體外溶栓特點,為后續(xù)工作的展開奠定了基礎。
　　1、為提高枯草桿菌蛋白酶的產量,采用單因素實驗設計,通過搖瓶培養(yǎng)對枯草桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化,結果表明,優(yōu)

3、化后培養(yǎng)基(w/v)為:麥芽糖1％、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.02%、KH2PO40.4%;最適發(fā)酵條件為:初始pH7、溫度37℃、接種量為1%,最佳培養(yǎng)時間為48h。
　　2、將枯草桿菌按最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)48h后,將發(fā)酵液進行4℃、4000rpm離心20min,然后將發(fā)酵上清液加入60%飽和度的硫酸銨進行鹽析、透析后冷凍干燥得到粗酶粉,然后利用CM-sepharose Fast Flow

4、對枯草桿菌蛋白酶進行分離純化,純化后得到純酶進行 SDS-PAGE驗證,最后得到的酶分子量顯示低于14.3KDa,且具有纖溶酶活性,前人文獻中未見報道,是一種新的溶栓酶。
　　3、為明確枯草桿菌蛋白酶的酶學性質,研究了溫度、pH、金屬離子對其穩(wěn)定性的影響。結果表明,枯草桿菌蛋白酶的最適反應溫度為60-70℃、溫度穩(wěn)定性范圍為40℃以下、最適反應pH為7,pH穩(wěn)定性范圍為6-8,未發(fā)現(xiàn)能增強該酶活性的金屬離子。
　　4、研究了