HoxC10在胃癌中的作用及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控p21的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　同源盒(homeobox，Hox)基因家族分為A、B、C和D四簇，排列在一條同源DNA鏈上，其編碼的同源蛋白是轉(zhuǎn)錄因子，通常在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基表達(dá)。若Hox基因異常表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常，并可能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤。目前HoxC10與腫瘤的相關(guān)研究報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)HoxC10在乳腺癌原發(fā)灶中表達(dá)上調(diào)，化療失敗后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中的HoxC10表達(dá)水平升高更明顯，HoxC10的高表達(dá)

2、與接受化療的乳腺癌（雌激素受體陰性）患者的預(yù)后不良相關(guān)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)HoxC10在宮頸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與官頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。迄今為止，HoxC10影響腫瘤生物學(xué)行為的具體分子機(jī)制尚未闡明，也無(wú)HoxC10在胃癌中作用的相關(guān)研究報(bào)道。
　　胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一。目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生發(fā)展是多因素多階段的過程，涉及一系列癌基因激活和抑癌基因失活等分子變化。尋找胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子及其相互關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步闡明胃癌

3、的發(fā)病機(jī)制，提供更加精確的臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療方案具有重要的意義。我們前期利用胃癌組織基因芯片篩選，首次發(fā)現(xiàn)HoxC10在胃癌組織中較癌旁組織高表達(dá)。為了闡明HoxC10在胃癌中的功能和分子作用機(jī)制，我們做了進(jìn)一步研究。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1、HoxC10在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義:通過對(duì)來(lái)自浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院和浙一醫(yī)院的2個(gè)胃癌臨床隊(duì)列進(jìn)行檢測(cè)，分析HoxC10在胃癌和相應(yīng)癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)水平差異及其與胃

4、癌患者臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性;運(yùn)用TheCancer Genome Atlas(TCGA)癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)、KM-plotter生存分析數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行佐證，明確HoxC10在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。
　　2、HoxC10對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:改變HoxC10的表達(dá)（過表達(dá)或敲減）并結(jié)合體外細(xì)胞功能試驗(yàn)和體內(nèi)裸鼠胃癌移植瘤動(dòng)物模型，研究HoxC10在胃癌惡性生物學(xué)行為（細(xì)胞增殖、周期調(diào)控、侵襲和遷移）中的作用。
　　3、

5、HoxC10潛在下游靶基因的篩選及驗(yàn)證:采用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)，篩選HoxC10基因潛在的下游靶基因并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證;結(jié)合表達(dá)改變情況和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息學(xué)預(yù)測(cè)，篩選出p21進(jìn)一步研究。
　　4、HoxC10在p21轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用及分子機(jī)制研究:通過改變HoxC10的表達(dá)，結(jié)合熒光定量PCR、免疫印跡等技術(shù)，在細(xì)胞、組織水平驗(yàn)證HoxC10和p21的表達(dá)相關(guān)性;免疫印跡技術(shù)檢測(cè)在敲減HoxC10后，p21下游周

6、期相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)改變;利用應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、染色質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)，探討并揭示胃癌HoxC10對(duì)p21的轉(zhuǎn)錄抑制分子調(diào)控機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1、HoxC10在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義
　　(1)新鮮冰凍胃癌及其配對(duì)癌旁非腫瘤組織樣本(n=70)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)HoxC10在胃癌組織中的mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（高表達(dá)比例為91.43％，64/70，P＜0.01）。

7、免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)HoxC10的蛋白表達(dá)，證實(shí)了較癌旁配對(duì)非腫瘤組織，胃癌組織中HoxC10的蛋白水平亦明顯增高。分析HoxC10的表達(dá)水平與患者臨床病理特征間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HoxC10的表達(dá)水平與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期顯著相關(guān)(P＜0.01)。
　　(2)胃癌組織石蠟標(biāo)本，定制組織芯片。通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)HoxC10在胃癌組織中普遍高表達(dá)(91.3％，137/150，P＜0.0

8、1)，HoxC10的蛋白表達(dá)與患者性別、腫瘤浸潤(rùn)深度及腫瘤分期顯著相關(guān)(n=195，P＜0.01)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HoxC10高表達(dá)的患者預(yù)后較差，風(fēng)險(xiǎn)比為2.223(95％ CI1.361-4.186)。多因素COX回歸分析，發(fā)現(xiàn)HoxC10的高表達(dá)是胃癌預(yù)后差的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
　　(3)比對(duì)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)胃癌和癌旁組織中的差異基因，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中HoxC10表達(dá)上調(diào)高達(dá)122倍(n=3

9、3，P＜0.01)。在KM-plotter胃癌數(shù)據(jù)庫(kù)(n=876)中，HoxC10高表達(dá)的患者預(yù)后差，風(fēng)險(xiǎn)比為1.8(95％ CI1.5-2.16)。
　　2、HoxC10對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　(1)CCK8、克隆形成等細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxC10顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，而干擾HoxC10則抑制細(xì)胞的增殖。
　　(2)采用流式細(xì)胞周期檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxC10后胃癌細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換明顯加快，干

10、擾HoxC10后細(xì)胞阻滯在G1期。應(yīng)用細(xì)胞周期同步化藥物諾考達(dá)唑(Nocodazole)處理細(xì)胞，進(jìn)一步證明敲減HoxC10使胃癌細(xì)胞周期阻滯在G1期。
　　(3)采用雙重染色流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxC10抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，而敲減HoxC10的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　(4)Transwell試驗(yàn)表明過表達(dá)HoxC10能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，而HoxC10表達(dá)下調(diào)則抑制細(xì)胞的遷移、侵襲。
　　

11、(5)胃癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxC10后裸鼠瘤體的生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯增快，而干擾HoxC10可減慢瘤體的生長(zhǎng)速度。
　　3、HoxC10潛在下游靶基因的篩選及驗(yàn)證
　　(1)在胃癌細(xì)胞BGC中敲減HoxC10并做表達(dá)譜基因芯片分析，以差異倍數(shù)＞1.3為界，并結(jié)合差異基因的功能分析，我們篩選出一系列差異表達(dá)的mRNA，如ELF5、PRDM2、AKT3、CDKN1A(p21)、SLC39A10、ZEB1、NRP2等。

12、r>　　(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在胃癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。其中PRDM2、AKT3和p21等在敲減HoxC10的胃癌細(xì)胞株中顯著上調(diào)，ZEB1、NRP2等顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　(3)借助Genomatix和JASPAR兩個(gè)在線轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析發(fā)現(xiàn)HoxC10與p21啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。
　　4、HoxC10在p21轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用及分子機(jī)制研究
　　(1)在多株胃癌細(xì)胞中改變(

13、過表達(dá)和敲減)HoxC10的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxC10，p21的表達(dá)水平相對(duì)下調(diào)，而敲減HoxC10后，p21的表達(dá)相對(duì)上調(diào);在裸鼠胃癌移植瘤組織中，免疫組化分析HoxC10和p21的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)二者呈負(fù)相關(guān);在穩(wěn)定敲減HoxC10的胃癌細(xì)胞中，p21及其下游周期相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵分子CDK2、CDK4、c-Myc、CyclinD1、pRb等的表達(dá)發(fā)生改變。
　　(2)采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)，分析HoxC10表達(dá)改變對(duì)p2

14、1轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxC10明顯抑制p21的轉(zhuǎn)錄活性，而干擾HoxC10的表達(dá)，p21的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。
　　(3)設(shè)計(jì)針對(duì)p21基因啟動(dòng)子區(qū)的引物，采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)HoxC10與P21啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。
　　研究結(jié)論:
　　1、在胃癌組織中HoxC10普遍高表達(dá)，且與腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤分期及臨床預(yù)后相關(guān)，HoxC10高表達(dá)是胃癌預(yù)后差的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
　　2、Hox