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文檔簡介
1、肝臟是身體內(nèi)極其重要的代謝器官,其功能的失調(diào)會影響機體正常的新陳代謝和內(nèi)環(huán)境的變化。原發(fā)性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是一類發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤,一般由化學(xué)致癌物或環(huán)境因素引發(fā)的慢性肝病或肝硬化發(fā)展而來,但是目前發(fā)病機制還未闡明,病理診斷和治療手段有一定的局限性。同種異體肝移植是目前治療PLC最徹底、有效的方法,但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是醫(yī)療界所面臨的問題。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)用于PLC早期診斷以
2、及治療作用評估的新生物標(biāo)記物。
近年來,隨著分子生物學(xué)基因芯片技術(shù)的發(fā)展,越來越多的研究者利用該技術(shù)探索了各類生物小分子與疾病的關(guān)系,而環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是目前研究重大疾病分子機理的熱點。circRNA是一類保守性好、特異性高,對靶基因能發(fā)揮調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA,利用circRNA微陣列芯片技術(shù),對circRNA進行表達譜的構(gòu)建,篩選出具有差異表達的circRNA作為疾病相關(guān)的生物標(biāo)
3、志物,并對其進行功能研究,可以使我們更好地了解疾病發(fā)生的分子機制,進而提高相關(guān)疾病的預(yù)防和診斷水平。
目的:利用circRNA微陣列芯片分析圍手術(shù)期PLC肝移植患者和健康對照者外周血circRNA表達譜,通過比較未實施肝移植術(shù)前患者與實施肝移植術(shù)后患者、健康對照者之間差異性表達的circRNA,篩查PLC特異表達的circRNA以及移植術(shù)后早期肝功能恢復(fù)相關(guān)的circRNA,為PLC早期診斷、預(yù)后以及治療提供新的信息。
4、 方法:收集2014年12月1日至2015年8月31日于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院確診為PLC并進行肝移植手術(shù),且治療效果較好的4例患者的臨床資料及外周血標(biāo)本,其中患者外周血標(biāo)本分為術(shù)前組(采集于PLC患者肝移植術(shù)前1天)、術(shù)后組(采集于患者肝移植術(shù)后1天、術(shù)后3天、術(shù)后7天)。健康對照組4例外周血標(biāo)本采集于與PLC患者年齡、性別和民族等匹配的健康人群。利用Trizol法提取總RNA,使用NanoDrop ND-1000檢測RNA是否
5、降解并測定RNA濃度;采用circRNA微陣列芯片分析PLC患者肝移植圍手術(shù)期和健康對照者circRNA表達譜。對肝移植術(shù)前組、術(shù)后組以及健康對照組表達的circRNA進行組間差異比較,篩選出與PLC特異表達以及移植術(shù)后早期肝功能恢復(fù)相關(guān)的circRNA。最后,應(yīng)用RT-PCR驗證circRNA微陣列芯片分析的準(zhǔn)確性,并利用miRNA靶向結(jié)合位點預(yù)測軟件預(yù)測與miRNA吸附相關(guān)的circRNA,分析circRNA的功能。
結(jié)果
6、:(1)在肝移植術(shù)前與術(shù)后自身對照比較研究中,PLC患者肝移植術(shù)后組(術(shù)后1天、3天、7天)circRNA歸一化均值/PLC患者肝移植術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≥2.0(fold change≥2.0)的circRNA有120個,說明這120個circRNA在肝移植術(shù)后組中上調(diào)表達。PLC患者肝移植術(shù)后組(術(shù)后1天、3天、7天)circRNA歸一化均值/PLC患者肝移植術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≤-2.0(fold change
7、≤-2.0)的circRNA有182個,說明這182個circRNA在肝移植術(shù)后組中下調(diào)表達。
(2)在PLC肝移植術(shù)前、術(shù)后分別與健康對照組比較研究中,術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值/健康對照組circRNA歸一化數(shù)值≥2.0∩術(shù)后組circRNA歸一化均值/術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≤-2.0的circRNA有165個;術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值/健康對照組circRNA歸一化數(shù)值≤-2.0∩術(shù)后組circRNA歸
8、一化均值/術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≥2.0的circRNA有80個。
(3)165個circRNA在機體存在腫瘤時表達上調(diào),實施PLC肝切除及肝移植術(shù)后表達下調(diào),可能是與PLC相關(guān)生物標(biāo)記物,miRNA靶向結(jié)合位點預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)其中的hsa_circRNA_102347與miR-203存在相互作用位點,且已有文獻報道m(xù)iR-203為肝癌特異性表達miRNA。而80個circRNA在機體存在腫瘤時表達下調(diào),實施PLC肝切
9、除及肝移植術(shù)后表達上調(diào),推測其可能與肝移植術(shù)后早期肝功能恢復(fù)有關(guān),miRNA靶向結(jié)合位點預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)其中的hsa_circRNA_400031與miR-483-5p存在相互作用位點,且已有文獻報道m(xù)iR-483-5p與肝癌發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系。
(4) RT-PCR驗證表明 hsa_circRNA_400031、 hsa_ circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102
10、347的表達情況與芯片分析結(jié)果基本一致。此外, RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn) hsa_circRNA_102032、 hsa_ circRNA_103096和hsa_circRNA_102347在肝移植術(shù)前組的表達量相對于健康對照組極其顯著上調(diào)(p<0.01),并且在肝移植術(shù)后1天、3天、7天有著顯著下調(diào)的趨勢,可能是機體PLC切除及肝移植預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物。
結(jié)論:(1) PLC患者實施肝摘除和肝移植前后存在大量差異表達circR
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