CAI抗腫瘤作用機(jī)制及聯(lián)合用藥的初步研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界上癌癥相關(guān)死因中發(fā)生率最高的癌癥種類之一，因此尋找有效的、不良反應(yīng)小的、作用明確以及聯(lián)合用藥治療策略是醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)課題。羧胺三唑(Carboxyamidotriazole，CAI)是本課題組多年來(lái)研究的一種毒副作用很低的非細(xì)胞毒類新型抗癌藥，其對(duì)體內(nèi)/外多種腫瘤模型有良好的抑制作用，但是CAI在人體臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)的抗腫瘤作用較溫和。
　　目的：
　　為了增強(qiáng)CAI的藥物治療效果以及探索CAI的作用及作用機(jī)理

2、，開(kāi)展了三部分的研究:(1)評(píng)估CAI與索拉非尼(S orafenib)協(xié)同抗腫瘤作用，并探討其可能的機(jī)制;(2)探索CAI在惡病質(zhì)小鼠中起到的保護(hù)性作用;(3)探尋CAI在腫瘤細(xì)胞提升磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）作用的上游機(jī)制。
　　索拉非尼是一種口服的多激酶抑制劑，可通過(guò)抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)可通過(guò)抑制PDGF和VEGF受體酪氨酸激酶的活性，

3、而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。索拉非尼可以延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期，但是總體療效有限。本部分研究探索CAI與索拉非尼在非小細(xì)胞肺癌中的協(xié)同治療作用以及其發(fā)揮協(xié)同作用可能的機(jī)制，旨在為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供新的方案并提供理論依據(jù)。
　　此外伴隨癌癥產(chǎn)生的癌性惡病質(zhì)是一種以全身性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)為特征的紊亂綜合癥，它的發(fā)生不僅對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的不良影響，還可以使患者對(duì)化療藥物反應(yīng)度降低并最終降低生存率。CAI除了具有抗癌特

4、性之外其在多種疾病模型中均體現(xiàn)出良好的抗炎作用。基于CAI的這種抗炎特性，同時(shí)在此探討CAI對(duì)腫瘤進(jìn)展中出現(xiàn)的肌肉萎縮現(xiàn)象是否具有保護(hù)與治療作用。
　　在本研究中發(fā)現(xiàn)CAI對(duì)乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）有抑制作用，為了更深入的探討CAI抗腫瘤作用的具體分子機(jī)制，在此對(duì)于引起ACC抑制的上游信號(hào)通路進(jìn)行探討。
　　方法：
　　用SRB法檢測(cè)CAI和/或索拉非尼在三株非小細(xì)胞肺癌

5、細(xì)胞株中的增殖抑制作用，并計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù)，并計(jì)算CAI對(duì)LLC細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。用AnnexinⅤ/PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。用DCFH-DA對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧進(jìn)行染色并分別用熒光顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行定性與定量分析。用MitoSox對(duì)線粒體特異的超氧化物進(jìn)行染色并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。NANOG的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別用熒光定量PCR和western blot進(jìn)行分析。堿性成纖維生長(zhǎng)因

6、子(bFGF)作為NANOG的刺激劑，在LLC和A549細(xì)胞中與藥物共孵育來(lái)考察NANOG在CAI和索拉非尼引起活性氧積累中的作用。使用GSH(ROS的清除劑)或bFGF與藥物共孵育并用流式細(xì)胞術(shù)的方法對(duì)細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行檢測(cè)。建立荷瘤小鼠模型，并評(píng)價(jià)CAI與索拉非尼在體內(nèi)的抑制腫瘤的作用。
　　建立晚期肺癌移植瘤模型，評(píng)估CAI對(duì)小鼠去瘤體重的保護(hù)作用。使用Western blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）對(duì)給藥29

7、天后對(duì)其腓腸肌中的蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行檢測(cè)。用ELISA的方法檢測(cè)血清中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平。CAI在體外對(duì)SIRT1的直接激活作用通過(guò)熒光定量的方法進(jìn)行測(cè)定。
　　用western blot方法檢測(cè)CAI對(duì)磷酸化ACC水平的影響，并通過(guò)使用鈣凋蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)阻滯劑STO609、具有肝激酶B1(Liver kinase B1，LKB1)突變的A549細(xì)胞、SIRT1抑制劑Ex

8、527和煙酰胺以及PKA抑制劑H-89與CAI共孵育，再檢測(cè)磷酸化ACC的水平來(lái)判斷上游信號(hào)通路對(duì)磷酸化ACC的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在非小細(xì)胞肺癌株(LLC、A549和NCI-H1975)中CAI與索拉非尼協(xié)同抑制細(xì)胞增殖。
　　2.CAI與索拉非尼聯(lián)合使用可以提升細(xì)胞凋亡水平以及上調(diào)cleaved-caspase3和cleaved-PARP的水平。同時(shí)使用Z-VAD-FMK(pan-caspase抑制劑)與藥

9、物共孵育可以減少藥物引起的細(xì)胞凋亡水平。
　　3.CAI與索拉非尼合用可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，同時(shí)也提升線粒體特異的超氧化物的產(chǎn)生。
　　4.CAI與索拉非尼合用可降低細(xì)胞中NANOG的mRNA與蛋白表達(dá)水平。在細(xì)胞中使用bFGF，可同時(shí)刺激細(xì)胞內(nèi)NANOG的表達(dá)以及刺激細(xì)胞增殖。
　　5.將bFGF與藥物共孵育，可以減輕藥物誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生。
　　6.將GSH（活性氧清除劑）或bFGF與藥物進(jìn)行共孵育，可

10、以減緩藥物引發(fā)的細(xì)胞凋亡比例。
　　7.在體內(nèi)試驗(yàn)中，CAI與索拉非尼(10mgkg-1)合用可以顯著的抑制腫瘤的生長(zhǎng)，這種抑制能力與索拉非尼高劑量單用組(30mg kg-1)相當(dāng)。同時(shí)CAI和索拉非尼合用組與索拉非尼高劑量組比較，前者的小鼠去瘤體重更重。
　　8.CAI和索拉非尼合用可以降低小鼠腫瘤組織中的NANOG的蛋白含量，并且可以提升腫瘤組織中的脂質(zhì)過(guò)氧化水平。
　　9.在癌性惡病質(zhì)模型鼠中，從接種腫瘤細(xì)胞后第

11、19天開(kāi)始，CAI給藥組小鼠的去瘤體重與溶劑對(duì)照組比表現(xiàn)出顯著升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CAI組小鼠的腓腸肌與附睪脂肪組織的重量比溶劑對(duì)照組有顯著性的增加。
　　10.在腓腸肌組織中CAI通過(guò)抑制與蛋白水解相關(guān)的FoxO3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)以及泛素連接酶E3（MuRF1和atrogin1）的表達(dá)來(lái)抑制肌肉組織的消耗。同時(shí)在肌肉組織中CAI表現(xiàn)出上調(diào)IκBα蛋白水平以及下調(diào)磷酸化IKKα/β體現(xiàn)出對(duì)NF-κB信號(hào)通路有效的抑制。并且CAI下調(diào)血

12、清中的IL-6和TNF-α的含量，也下調(diào)肌肉中的TNF-α的水平。在體外實(shí)驗(yàn)中CAI體現(xiàn)出對(duì)SIRT1酶的直接激活作用，在腓腸肌組織中CAI組小鼠的SIRT1蛋白表達(dá)量顯著上升。
　　11.CAI在體外可以劑量依賴的提升細(xì)胞內(nèi)磷酸化ACC的水平。
　　12.CAI的提升磷酸化ACC水平的作用是非依賴CaMKKβ和LKB1的，同時(shí)是部分依賴于SIRT1和PKA活力的。
　　結(jié)論：
　　CAI與索拉非尼在體內(nèi)與體外實(shí)