黃芩苷對LPS誘導的腸上皮細胞損傷的保護及機制探討.pdf

1、目的：由單層的腸上皮細胞及細胞間的連接組成的機械屏障是腸黏膜屏障中重要的組成部分，可抵御外來微生物及毒素的入侵。其中緊密連接是細胞間重要的連接方式，緊密連接的完整性對維持腸黏膜功能具有至關(guān)重要的作用。機體內(nèi)脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)含量增加，可破壞緊密連接完整性，損傷腸黏膜屏障功能，而腸黏膜屏障功能受損，細胞旁屏障滲透性增加，又可導致腸道細菌和（或）LPS進入循環(huán)系統(tǒng)，形成惡性循環(huán)，危害機體健康。黃芩苷(b

2、aicalin)是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類活性成分，具有廣泛的藥理作用，尤其在抗炎及治療腸道疾病方面具有良好的藥效。本研究旨在從細胞水平和分子水平方面探討黃芩苷對LPS誘導的IEC-6細胞的保護作用，一方面為闡明黃芩苷對LPS誘導的IEC-6的細胞增殖、炎性反應、凋亡、遷移能力及細胞間緊密連接等的保護作用及其相關(guān)作用機制提供研究基礎(chǔ);另一方面為細菌導致的腸黏膜屏障損傷及相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供新的思路和依據(jù)。
　　方法：采用MT

3、T法對黃芩苷進行細胞毒性檢測。用不同濃度的LPS誘導IEC-6細胞，采用MTT法和ELISA分別檢測LPS對IEC-6細胞增殖及分泌IL-6和TNF-α的影響，確定建立細胞炎癥模型的LPS濃度。采用MTT法和ELISA檢測黃芩苷對模型細胞增殖及分泌炎癥因子IL-6和TNF-α的影響;采用Hoechst33258染色法和流式細胞術(shù)檢測黃芩苷對模型細胞細胞核凋亡形態(tài)學改變及凋亡率的影響;采用細胞劃痕實驗探討黃芩苷對模型細胞遷移能力的影響;采

4、用qRT-PCR法檢測黃芩苷對模型細胞Claudin-3、Occludin和ZO-1等mRNA表達的影響;采用細胞免疫化學法和Western blot檢測黃芩苷對以上有表達差異的基因進行蛋白表達的檢測。
　　結(jié)果：⑴與對照組比較，2.5、5.0和10.0μ g/mL黃芩苷組細胞生存率均無明顯差異(P＞0.05)。⑵與對照組比較，1.0μ g/mL LPS組IEC-6細胞生存率顯著降低（P＜0.01）;IL-6和TNF-α分泌量及細

5、胞凋亡率均明顯增加（均為P＜0.01）;部分細胞核凋亡形態(tài)學發(fā)生改變，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為亮藍色的細胞核固縮和細胞核碎裂呈分葉狀;細胞遷移能力明顯下降（P＜0.01）;Claudin-3 mRNA的表達無明顯差異（P＞0.05），而Occludin和ZO-1 mRNA的表達顯著下調(diào)（均為P＜0.01）;緊密連接Occludin和ZO-1蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，分布較散，連接之間出現(xiàn)較長距離的斷裂;此外，ZO-1蛋白的表達明顯下調(diào)（P＜0.01

6、）。⑶與模型組比較，5.0和10.0μg/mL黃芩苷組細胞生存率明顯提高（P＜0.01）;2.5、5.0和10.0μg/mL黃芩苷組凋亡細胞均減少，其中10.0μg/mL黃芩苷組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），絕大多數(shù)細胞細胞核大小均一，呈圓形或橢圓形，未出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)學改變;細胞遷移能力明顯提高(P＜0.01)。同時，10.0μ g/mL黃芩苷組細胞IL-6和TNF-α分泌量顯著減少(分別為P＜0.05 P＜0.01）;ZO-1

7、 mRNA的表達顯著增加（P＜0.05），但Occludin mRNA的表達無明顯差異（P＞0.05）;細胞間緊密連接蛋白ZO-1分布明顯改善，甚至恢復至正常水平，而Occludin蛋白的分布未見明顯改善;此外，ZO-1蛋白的表達顯著上調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：①LPS能抑制正常IEC-6細胞增殖，誘導該細胞凋亡及分泌炎癥因子IL-6和TNF-α，同時降低細胞遷移能力及IEC-6細胞Occludin、ZO-1 mRNA和蛋白