木聚糖誘導(dǎo)條件下黑曲霉特異基因表達(dá)分析及高表達(dá)堿性木聚糖酶產(chǎn)黃青霉菌株構(gòu)建研究.pdf

1、植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)組成。木聚糖是植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素外最為豐富的多糖，也是自然界中主要的可再生資源。隨著人口增長(zhǎng)和資源消耗，對(duì)于可再生資源的開(kāi)發(fā)與利用成為學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的問(wèn)題。
　　 絲狀真菌黑曲霉作為具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物物質(zhì)水解酶工業(yè)生產(chǎn)菌株已有多年歷史，其全基因組測(cè)序已經(jīng)完成。黑曲霉生產(chǎn)的半纖維素酶和降解復(fù)雜多糖的其它水解酶類(lèi)已被廣泛應(yīng)用于食品、紡織和制漿造紙工業(yè)等行業(yè)。黑

2、曲霉能夠產(chǎn)生高活力的木聚糖酶。絲狀真菌木聚糖酶基因已經(jīng)大量克隆并進(jìn)行了表達(dá)，研究的水平已深入到分子水平，而且對(duì)基因表達(dá)調(diào)控也進(jìn)行了一定的研究，但是研究主要針對(duì)單基因或幾個(gè)基因，從基因組水平和蛋白組水平上進(jìn)行全面地、系統(tǒng)性地研究的很少，無(wú)法反映出絲狀真菌木聚糖分解代謝的全貌，而且至今對(duì)木聚糖酶的分子誘導(dǎo)機(jī)制了解還比較少。因此，從基因組水平上研究絲狀真菌半纖維素分解在基礎(chǔ)理論與應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究中都顯得很有必要。其中一些重要新基因功能的闡明有助于

3、明晰黑曲霉木聚糖酶的誘導(dǎo)機(jī)理、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控或重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，對(duì)優(yōu)化黑曲霉的發(fā)酵、產(chǎn)酶過(guò)程及菌株的定向遺傳改造將具有積極的推動(dòng)作用。本文以黑曲霉為研究對(duì)象，采用抑制性消減雜交技術(shù)對(duì)在木聚糖誘導(dǎo)下及未誘導(dǎo)下進(jìn)行基因差異表達(dá)的研究。
　　 目前對(duì)絲狀真菌的宿主表達(dá)系統(tǒng)主要集中在Trichoderma reesei和A.niger，關(guān)于產(chǎn)黃青霉的研究較少，主要是對(duì)其抗生素的合成調(diào)控進(jìn)行了細(xì)致深入的研究。產(chǎn)黃青霉是許多酶制劑和抗生素等

4、的工業(yè)生產(chǎn)菌，能分泌合成蛋白酶、木聚糖酶和葡萄糖氧化酶。它具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，當(dāng)在含有1％木聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液中木聚糖酶的含量高達(dá)40％，這表明產(chǎn)黃青霉的木聚糖酶啟動(dòng)子屬于強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠向胞外分泌大量的蛋白，因此產(chǎn)黃青霉是優(yōu)良的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，是一種潛在的“細(xì)胞工廠”。另一方面，產(chǎn)黃青霉纖維素酶活性極低。這些特點(diǎn)對(duì)于表達(dá)用于改善紙漿質(zhì)量和生物漂白的堿性木聚糖酶基因是非常有利的，本文究選用產(chǎn)黃青霉作為表達(dá)的

5、宿主系統(tǒng)高效對(duì)來(lái)自嗜堿桿菌的木聚糖酶基因進(jìn)行表達(dá)。
　　 本文的主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.高產(chǎn)木聚糖酶黑曲霉菌株的誘變及培養(yǎng)條件的優(yōu)化
　　 采用UV和硫酸二乙酯(DES)對(duì)黑曲霉進(jìn)行誘變，篩選到一株酶活達(dá)6235U/ml的突變菌株，編號(hào)為An-19。對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行了掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)與出發(fā)菌株相比，突變株的分生孢子呈現(xiàn)棕黃色，體積偏大，菌絲直徑增粗。生長(zhǎng)速度快，3 d就能覆蓋整個(gè)平板。對(duì)突變株和出發(fā)株的木

6、聚糖酶基因進(jìn)行了克隆，測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩者基因的相似度為100％，說(shuō)明誘變沒(méi)有改變木聚糖酶基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)突變株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)10代后突變株的木聚糖酶活性保持不變，說(shuō)明突變株是一株產(chǎn)木聚糖酶穩(wěn)定的菌株。采用中心組合試驗(yàn)和Design-Expert7.0軟件對(duì)突變株的培養(yǎng)條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果得到最佳培養(yǎng)基為麩皮20g/L，NH4NO310g/L和碳酸鈣20g/L，優(yōu)化條件下酶活高達(dá)8516U/mL，比出發(fā)菌株提高56.31％

7、。
　　 2.黑曲霉抑制性消減雜交文庫(kù)的構(gòu)建及差異序列的分析
　　 為了分離和鑒定黑曲霉木聚糖代謝相關(guān)基因，以經(jīng)過(guò)1.0％木聚糖誘導(dǎo)的菌絲體為實(shí)驗(yàn)組，未誘導(dǎo)的為驅(qū)動(dòng)組，用抑制消減雜交法(SSH)構(gòu)建了黑曲霉木聚糖誘導(dǎo)正向消減文庫(kù)。菌落PCR顯示插入片段在250～1000 bp之間，逆向斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證黑曲霉消減文庫(kù)質(zhì)量良好。從黑曲霉木聚糖誘導(dǎo)的消減文庫(kù)中，隨機(jī)選取了119個(gè)不同插入片段的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST

8、x分析，表明這些序列大部分與絲狀真菌木聚糖代謝的相關(guān)酶基因具有較高的相似性。總共篩選出41個(gè)有效的差異表達(dá)基因cDNA片段，其中有7個(gè)cDNA片段編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，占測(cè)序克隆的5.9％，包括糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因4個(gè)，分別為木二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。共有22個(gè)cDNA片段編碼水解酶，占測(cè)序克隆的18.4％；其中，編碼糖苷水解酶的基因有12個(gè)包括內(nèi)切木聚糖酶A和B、β-木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、α-半乳糖苷酶

9、、β-葡萄糖苷酶、D-木酮糖激酶，以及木糖醇脫氫酶、醛糖差向異構(gòu)酶、內(nèi)切葡聚糖酶A、α-葡萄糖醛酸酶和阿魏酸酯酶基因。搜索黑曲霉的基因組序列，獲得特異表達(dá)序列的全長(zhǎng)序列。對(duì)完整基因序列分析發(fā)現(xiàn)，特異表達(dá)的糖苷水解酶基因除了阿拉伯糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因外，其余基因的啟動(dòng)子區(qū)域中均含有特異序列5'-GGCTAA，而該序列可以和XlnR發(fā)生特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)木聚糖酶系基因的表達(dá)。此外，發(fā)現(xiàn)纖維素酶系中的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅲ和β-葡萄糖苷酶基因

10、啟動(dòng)子區(qū)也含有5'-GGCTAA序列，表明受到XlnR的調(diào)控，這說(shuō)明XlnR除了作為木聚糖酶轉(zhuǎn)錄激活因子外，還參與調(diào)控纖維素降解酶部分基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 對(duì)篩選出來(lái)的6個(gè)木聚糖水解酶基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果在誘導(dǎo)組RT-PCR中均擴(kuò)增獲得明亮的PCR條帶，試驗(yàn)結(jié)果表明這6個(gè)基因是在木聚糖誘導(dǎo)下能夠進(jìn)行特異表達(dá)，而在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)則基本不表達(dá)。特異基因RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了所構(gòu)建黑曲霉消減文庫(kù)的質(zhì)量。

11、黑曲霉消減文庫(kù)中分離得到的木聚糖特異表達(dá)基因的分離為深入研究木聚糖誘導(dǎo)與代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.產(chǎn)黃青霉胞外蛋白酶的分離純化及蛋白酶缺陷型菌株的構(gòu)建
　　 采用硫銨分級(jí)沉淀、DEAE離子交換層析和分子篩層析對(duì)產(chǎn)黃青霉FS010的胞外蛋白酶進(jìn)行初步的分離。SDS-PAGE電泳分析顯示產(chǎn)黃青霉FS010菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶種類(lèi)較少，在分子量約43kDa處有1條明顯的蛋白帶，對(duì)分離純化的蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，研究表

12、明該蛋白酶的最適作用溫度為35℃，最適作用pH為9.0。蛋白酶抑制劑的研究顯示該酶屬于絲氨酸蛋白酶。
　　 以黑曲霉、微紫青霉的天冬氨酸蛋白酶PepA作為檢索內(nèi)容，對(duì)Penicilliumchrysogenum的pepA同源基因進(jìn)行搜索。結(jié)構(gòu)搜索到1個(gè)基因編號(hào)為8313187，蛋白編號(hào)為XP_002567415.1的基因，將其命名為pepA，該基因初步認(rèn)為編碼天冬氨酸蛋白酶A，屬于酸性蛋白酶。將搜索到的基因片段的上游非編碼區(qū)和下

13、游區(qū)也進(jìn)行整理，最終獲得pepA的全長(zhǎng)序列，其中上游非編碼區(qū)長(zhǎng)度為1099bp，下游非編碼區(qū)為563bp。
　　 體外成功構(gòu)建了產(chǎn)黃青霉天冬氨酸蛋白酶基因pepA敲除載體p△pepA，并將其轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉原生質(zhì)體，成功篩選獲得3株轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證和Southern雜交證實(shí)這3株轉(zhuǎn)化子的pepA基因已經(jīng)被敲除。對(duì)3株缺轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵上清中總蛋白及蛋白酶活性進(jìn)行了測(cè)定，證實(shí)轉(zhuǎn)化子△PEP14的胞外蛋白酶活性降低最顯著，相比出發(fā)菌株

14、降低了80.9％；而另外兩株轉(zhuǎn)化子的胞外蛋白酶活性比出發(fā)菌株分別降低了61.2％和40.2％。酶活測(cè)定結(jié)果表明產(chǎn)黃青霉天冬氨酸蛋白酶A的缺失能降低發(fā)酵液胞外蛋白酶活性，但發(fā)酵液總蛋白含量保持相對(duì)恒定。對(duì)pepA缺失轉(zhuǎn)化子△PEP14的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示△PEP14轉(zhuǎn)化子具有較好的遺傳穩(wěn)定性，傳10代后仍能保持較低胞外蛋白酶活性。
　　 4.堿性木聚糖酶基因在產(chǎn)黃青霉蛋白酶缺陷菌株中的分泌表達(dá)
　　 根據(jù)產(chǎn)黃青

15、霉中密碼子的偏愛(ài)性，利用Codon-Adaptation tool對(duì)來(lái)自于嗜堿桿菌堿性木聚糖酶基因序列xyl進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的xyl1序列的CAI值為0.99，GC含量為60.94％，比出發(fā)序列提高了61.2％。Blast分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的序列和原始序列核酸相似性為74％。
　　 以質(zhì)粒pUC19為載體骨架，選用產(chǎn)黃青霉酸性木聚糖酶基因(xyn)的強(qiáng)啟動(dòng)子Pxyn及終止子Txyn序列構(gòu)建細(xì)菌堿性木聚糖酶基因表達(dá)盒，成功得到重

16、組表達(dá)載體pxyl-1。將pxyl-1轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉原生質(zhì)體，篩選獲得4株轉(zhuǎn)化子。Southern雜交及RT-PCR分析證實(shí)這4株轉(zhuǎn)化子的堿性木聚糖酶基因xyl1能夠進(jìn)行特異表達(dá)。
　　 對(duì)產(chǎn)黃青霉pxyl-1轉(zhuǎn)化子X(jué)Y35所產(chǎn)的木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果證實(shí)重組堿性木聚糖酶在產(chǎn)黃青霉中可以分泌到胞外，用產(chǎn)黃青霉pxyl-1轉(zhuǎn)化子X(jué)Y35發(fā)酵上清液進(jìn)行了SDS-PAGE分析和堿性木聚糖酶活性測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與出發(fā)菌

17、株相比較，轉(zhuǎn)化子X(jué)Y35胞外蛋白樣品在約41kDa處出現(xiàn)了1條蛋白帶。酶活測(cè)定結(jié)果顯示，出發(fā)菌株木聚糖酶活為254.5 U/mg，上清液總蛋白含量為0.42 mg/mL，而轉(zhuǎn)化子為1217.9 U/mg，發(fā)酵上清液總蛋白含量為0.48 mg/mL。凝膠掃描分析表明木聚糖酶占胞外總蛋白的15.9％。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)化子X(jué)Y35的木聚糖酶粗酶液與出發(fā)菌株所產(chǎn)酸性木聚糖酶的性質(zhì)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示重組堿性木聚糖酶最適作用pH值為8.0

18、，而出發(fā)菌株所產(chǎn)的酶為6.0。重組酶穩(wěn)定pH范圍在6.0-11.0之間，在3-9.5范圍內(nèi)可保留80％以上酶活力，堿穩(wěn)定性較強(qiáng)，該菌株所產(chǎn)堿性木聚糖酶可望用于紙漿的預(yù)漂白。重組木聚糖酶和出發(fā)菌株的酸性酶的最適作用溫度均為40℃，溫度超過(guò)50℃后，重組酶的活力喪失大部分活性，到55℃，僅保留原有活性的42.3％，其耐熱穩(wěn)定性需要進(jìn)一步提高。本文利用產(chǎn)黃青霉作為宿主過(guò)表達(dá)外源基因的研究為產(chǎn)黃青霉的工業(yè)育種提供了試驗(yàn)范例和進(jìn)行了有益的探討。高