基于β-羥丁酸的神經保護作用研究生酮飲食抗癲癇機制.pdf

1、研究背景:
　　癲癇(epilepsy)是一種由神經元突然異常放電所引起的反復發(fā)作的短暫的大腦功能失調的慢性疾病，是僅次于腦血管病的神經系統(tǒng)常見病。我國癲癇的患病率高，約為3.6‰-4.4‰，以16歲以下的兒童和青少年居多。20％-30％癲癇患者雖經正規(guī)抗癲癇藥物治療2年以上，仍然反復發(fā)作得不到控制，成為難治性癲癇(intractable/refractory epilepsy)[1]。兒童期是大腦功能迅速發(fā)育成熟的重要階段，難治

2、性癲癇治療效果差，嚴重危害著兒童的身心健康。因此，開展兒童難治性癲癇的治療方面的研究，探索治療新靶點，具有重要的科學意義和臨床價值。
　　生酮飲食(ketogenic diet，KD)是一種高脂肪、低碳水化合物飲食方案，得名源于模擬禁食狀態(tài)下形成酮癥而產生酮體這一代謝過程，是目前治療兒童難治性癲癇的重要方法之一[2]。1921年Wilder首次用KD臨床治療癲癇并顯示了相對較好的療效。大量臨床研究和動物實驗證實了KD能夠有效控制癲

3、癇的發(fā)作，特別是針對兒童難治性癲癇的治療，副作用小且療效確切。臨床隨機調查發(fā)現(xiàn):進行KD療法3個月，75％的兒童癲癇發(fā)作減少[3-5]。關于生酮飲食的抗癇機制尚未完全闡明，近年來國內外研究提示可能與酮體的神經保護作用密切相關。但是，目前關于酮體神經保護的具體調控機制如何，尚不完全清楚。
　　本課題分為兩部分:一、通過HT22海馬細胞系的培養(yǎng)，建立谷氨酸損傷HT22細胞模型并研究酮體的主要成分β-羥丁酸對谷氨酸損傷HT22細胞的神經

4、保護作用。二、在氧化還原水平及細胞信號通路水平探討β-羥丁酸神經保護作用的調節(jié)機制。
　　第一部分β-羥丁酸對谷氨酸損傷HT22細胞具有神經保護作用
　　目的:難治性癲癇仍然是臨床治療的重要且棘手的問題，難治性癲癇的患者可以選用高脂肪、低碳水化合物的生酮飲食(ketogenic diet，KD)予以治療。近年來，生酮飲食在兒童難治性癲癇的治療中取得了良好的效果，進行生酮飲食治療時脂肪代替碳水化合物成為機體主要的能量來源，脂肪

5、在肝臟氧化產生大量乙酰輔酶A(CoA)，超過三羧酸循環(huán)能力，在肝臟線粒體內大量合成β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate，BHB)、乙酰乙酸(acetoacetate，ACA)、丙酮三種酮體。低碳水化合物飲食情況下，機體能量主要來自酮體。大量臨床研究和動物實驗表明，KD治療難治性癲癇能夠顯著提高血清和尿液中酮體β-羥丁酸的含量[6]，提示β-羥丁酸可能在其抗癇機制中發(fā)揮關鍵作用，但具體機制尚不明確。本課題占酮體總量78％的β-羥

6、丁酸為切入點，利用體外實驗系統(tǒng)，通過建立谷氨酸損傷HT22細胞模型，分析β-羥丁酸的神經保護功能，來探討β-羥丁酸的抗癇機制。
　　方法:體外培養(yǎng)小鼠海馬神經元細胞系HT22細胞，5mM谷氨酸（glutamate，GLU）處理HT22細胞24小時，建立神經細胞損傷模型，用MTT法檢測不同濃度BHB預處理24小時對HT22細胞存活率的影響，以及不同濃度BHB預處理對谷氨酸損傷HT22細胞存活率的影響，倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)，

7、Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察不同實驗組細胞損傷情況。
　　結果:
　　1、分別用2mM，4mM，8mM，10mM四種濃度的BHB預處理HT22細胞24小時，MTT法檢測各組細胞存活率，與正常對照組及組間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、MTT法檢測5mM的GLU處理組HT22細胞存活率降低明顯，與正常對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);4mM的BHB預處理組細胞的存活率比GLU組高，與GL

8、U組比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而8mM的BHB預處理組細胞的存活率比GLU組高，但與GLU組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3、倒置相差顯微鏡進行形態(tài)學觀察顯示:正常對照組的細胞生長狀態(tài)良好，細胞密度較大，數量多，細胞及細胞器完整，細胞核清晰:GLU組HT22細胞出現(xiàn)明顯的凋亡狀態(tài)，細胞密度低，數量少，細胞胞體皺縮，胞漿空泡多，核固縮，破碎，胞體及神經細胞突起斷裂、破碎，可見凋亡小體;BHB預處理組細胞密度較GL

9、U組大，數量較GLU組多，可見部分胞體腫脹，部分胞體皺縮，部分細胞細胞核固縮，凋亡小體較GLU組少見。
　　Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察顯示:正常對照組的細胞核為均勻的藍色，密度大，數量多，細胞核清晰均質，顏色較暗;GLU組細胞核多為明亮的藍色，稀疏，數量少，部分發(fā)白色光，核收縮，趨邊，破碎;BHB預處理組細胞核多呈藍色，密度較GLU組高，數量較GLU組多，部分為較明亮的藍色，少數發(fā)白色光，可見少量核固縮，趨邊。<

10、br>　　結論:
　　1、2-10mMBHB處理對HT22細胞存活率沒有影響，沒有神經細胞毒性;
　　2、GLU對HT22細胞具有損傷作用;
　　3、BHB對GLU損傷的HT22細胞具有保護作用，BHB可能通過其神經保護作用在生酮飲食抗癲癇中發(fā)揮作用。
　　第二部分β-羥丁酸神經保護作用機制的相關研究
　　目的:神經損傷是難治性癲癇發(fā)生的重要機制，生酮飲食抗癲癇的機制尚不明確，我們推斷與酮體有關。我們第一部

11、分研究發(fā)現(xiàn)BHB具有神經保護作用，但是具體調控機制尚未完全闡明。一些動物研究表明，在低血糖的動物模型和帕金森的動物模型中，BHB可能在氧化還原水平發(fā)揮其神經保護作用[7，8]。通過前面的實驗我們得知BHB對GLU誘導的海馬神經細胞的氧化損傷具有保護作用，β-羥丁酸是否參與調節(jié)氧化損傷誘導的神經細胞損傷、凋亡，調控機制如何，本部分擬采用GLU神經細胞損傷模型，從氧化還原水平，細胞信號轉導通路方面進一步研究β-羥丁酸的神經保護相關調節(jié)機制，

12、從而深入了解KD的抗癲癇治療機制，為臨床提供科學依據，并為優(yōu)化治療策略提供線索和方向。
　　方法:DCHF熒光探針檢測各組HT22細胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平;比色法檢測各組丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，Western blot檢測各組MAPK信號轉導通路中P38MAPK與JNK通路蛋白表達水平。
　　結果:
　　1、DCHF熒光探針檢測各組活性氧RO

13、S產生情況，通過激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):正常對照組（Control組），視野暗，隱約可見暗綠色的細胞形態(tài)，細胞胞體完整，細胞膜連續(xù);5mMGLU處理HT22細胞24小時組（GLU組），視野內可見較明亮的發(fā)綠色熒光的細胞胞體，部分細胞膜破碎，胞突斷裂;4mMBHB預處理12小時后，5mMGLU損傷24小時組（BHB+GLU組），視野較暗，可見發(fā)暗綠色或者綠色熒光的胞體，少數發(fā)較明亮的綠色熒光;對相對熒光量水平進行量化分析發(fā)現(xiàn):與正常對

14、照組Control組相比，GLU組細胞ROS表達明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;與GLU組相比，BHB+GLU組細胞ROS表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、各組丙二醛MDA含量的檢測結果顯示:
　　1) Control組為正常對照組，GLU組為5mMGLU損傷12小時組，BHB+GLU組為4mMBHB預處理12小時后，5mMGLU損傷12小時組:
　　GLU組MDA含量最高，與Con

15、trol組相比，MDA含量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;BHB+GLU組與GLU組相比，MDA含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　2) Control組為正常對照組，GLU組為5mMGLU損傷24小時組，BHB+GLU組為4mMBHB預處理12小時后，5mMGLU損傷24小時組:
　　GLU組MDA含量最高，與Control組相比，MDA含量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;B

16、HB+GLU組與GLU組相比，MDA含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、Wetern blot檢測各組P38和JNK的表達及磷酸化水平發(fā)現(xiàn):
　　Control組為正常對照組，GLU組為5mMGLU損傷組，BHB+GLU組為4mMBHB預處理12小時后，5mMGLU損傷組:GLU組P38磷酸化水平最高，與正常對照組Control組相比，磷酸化的P38水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），B

17、HB+GLU組與GLU組相比，磷酸化的P38水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05);JNK表達及磷酸化水平趨勢與P38一致。
　　結論:
　　1、BHB抑制GLU誘導的HT22細胞活性氧ROS和脂質過氧化物MDA的產生，從而在氧化還原水平起到保護作用;
　　2、GLU通過升高MAPK通路中P38與JNK的磷酸化水平，通過激活P38與JNK通路發(fā)揮其對神經細胞的損傷;
　　3、BHB降低MAPK通路中P38與