ApoE---小鼠頸總動脈粥樣硬化不同時間點自噬水平變化的研究.pdf

1、目的：
　　探究在載脂蛋白E基因敲除小鼠（即ApoE-/-小鼠）頸總動脈粥樣硬化的3個時間點自噬水平的變化情況。
　　方法：
　?。?）40只6周齡的SPF級雄性ApoE-/-小鼠，先給與普通飼料喂養(yǎng)2周，隨后隨機分成對照組（10只）與模型組（30只）。對照組進行假手術（ApoE-/-小鼠右側頸總動脈旁放置硅膠管）處理，而后繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)8周；模型組給與手術（右側頸總動脈外套置硅膠管）處理，手術后隨機分成3組（2周組

2、、4周組、8周組），每組各10只，并且均換成高脂飼料，分別喂養(yǎng)2周、4周、8周后處死。
　　（2）分離并剪斷ApoE-/-小鼠的股動脈進行取血，檢測每只ApoE-/-小鼠血清中甘油三脂（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL_c）的含量。
　?。?）ApoE-/-小鼠取血后處死，分離取出套管側頸總動脈，固定后做石蠟切片，HE染色，應用光學顯微鏡觀察每組血管壁結構的變化。
　?。?）離體的套管側頸總動脈經固

3、定后，做超薄切片并染色，應用透射電鏡觀察每組小鼠頸總動脈組織巨噬細胞的超微結構。
　?。?）提取各組ApoE-/-小鼠套管側頸總動脈組織的總RNA，經反轉錄后，應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測每組小鼠頸總動脈組織中ATG5、Beclin1的mRNA的相對表達量。
　　（6）提取各組 ApoE-/-小鼠套管側頸總動脈組織中的總蛋白，應用 western blot檢測每組小鼠頸總動脈組織中ATG5、Beclin1蛋白

4、的相對表達量。
　　結果：
　?。?）與對照組相比較，模型組ApoE-/-小鼠的血脂水平均升高（P＜0.05）；模型組中TG和LDL_c的表達水平隨著套管手術時間延長而逐漸升高（P＜0.05）。
　　（2）組織病理學觀察顯示，對照組ApoE-/-小鼠頸總動脈管壁結構比較完整，且彈性膜較為豐富。2周組小鼠管壁結構仍較完整，但是一小部分管壁增厚并見有少量細胞浸潤。4周組小鼠管壁結構較為凌亂，而且見有泡沫細胞、炎性細胞的浸潤

5、。8周組小鼠管壁明顯增厚而且有大量泡沫細胞、炎性細胞浸潤，彈性膜結構破壞且明顯減少，管腔狹窄。
　?。?）透射電鏡觀察顯示，與對照組相比較，模型組ApoE-/-小鼠頸總動脈組織巨噬細胞中的脂滴和自噬體數目均明顯增多，4周組巨噬細胞內脂滴和自噬體數目明顯多于2 周組，8周組巨噬細胞內的脂滴數目明顯多于4周組，但其自噬體數目遠遠少于4周組。（4）實時熒光定量PCR結果顯示，2周組ApoE-/-小鼠頸總動脈組織中ATG5、Be

6、clin1的mRNA的相對表達量與對照組無明顯差異（P＞0.05），4周組和8周組ATG5、Beclin1的mRNA的表達均高于對照組（P＜0.05）；4周組ATG5、Beclin1的mRNA的表達均高于2周組和8周組，而且，8周組ATG5、Beclin1的mRNA的表達高于2周組（P＜0.05）。（5）western blot結果顯示，2周組ApoE-/-小鼠頸總動脈組織中ATG5、Beclin1蛋白的相對表達量與對照組相比較無明顯差

7、異（P＞0.05），4周組和8周組ATG5、Beclin1蛋白的表達均高于對照組（P＜0.05）；4周組ATG5、Beclin1蛋白的表達均高于2周組和8周組，而且，8周組ATG5、Beclin1蛋白的表達高于2周組（P＜0.05）。
　　結論：
　　在 ApoE-/-小鼠頸總動脈粥樣硬化的疾病過程中，自噬在起始階段不斷激活，自噬水平逐漸升高，但是，自噬水平在動脈粥樣硬化的某一時間點（本實驗中為套管手術4周后）將會達到峰值，