細胞外基質支架材料在軟骨組織再生和骨組織工程中應用的初步探討.pdf

1、研究背景：
　　口腔頜面部骨、軟骨組織生物性再生修復是口腔醫(yī)學領域需要解決的棘手問題?？谇活M面部腫瘤、創(chuàng)傷以及先天性畸形等都會導致頜面部骨和軟骨組織的缺損，如下頜骨成釉細胞瘤、髁突發(fā)育不良、先天性上頜骨缺失等等。目前，臨床上治療骨缺損的金標準仍然是“自體骨移植”，但這種拆東墻補西墻的修復方式需要開辟第二戰(zhàn)場，給患者造成二次損傷，病人所受的傷害和所需的花費都要增加很多。組織工程和再生醫(yī)學的出現(xiàn)以及蓬勃發(fā)展，為醫(yī)學上治療這類缺損提供了

2、很好的方向。其中，支架材料作為組織工程領域的三大支柱之一，對組織工程的成功構建起著非常重要的作用。現(xiàn)在常用的支架材料主要分為兩類：一是來源于天然組織，如膠原等；二是人工合成的高分子支架材料，如PCL等。兩種材料都各有其優(yōu)勢和不足。其中，細胞外基質支架材料（ECM）由于其在組織形成和器官發(fā)育中的重要作用而被人們所熟悉并深入研究，而且，ECM對于細胞的生物學行為如遷移、增殖和分化等也有著直接的影響。因此ECM作為一種支架材料有著其獨特的優(yōu)勢

3、。本實驗就是著眼于探討ECM支架材料在軟骨再生和骨組織工程中的應用，為以后臨床應用ECM修復組織缺損提供一些可靠的依據(jù)。
　　第一部分：軟骨細胞來源的細胞外基質支架材料在軟骨再生中應用的初步探討
　　實驗一、軟骨細胞膜片的構建
　　目的：探討軟骨細胞膜片的構建方法，并分析其結構特征。
　　方法：分離4周齡幼兔的耳軟骨細胞，在高糖DMEM培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)2周；然后對獲得的膜片進行大體學、組織學和超微結構的觀察。<

4、br>　　結果：幼兔耳軟骨細胞分離后生長狀態(tài)良好，連續(xù)培養(yǎng)2周后即可形成膜片狀結構；HE和番紅O染色均證實了膜片是由軟骨細胞及其自身分泌的細胞外基質（Extracellular Matrix, ECM）構成，掃描電鏡（Scanning electronic microscope, SEM）和投射電鏡（Transmission electron microscope, TEM）也都證實了軟骨細胞膜片是由大量的ECM和鑲嵌在其中的軟骨細胞構

5、成。
　　結論：軟骨細胞經(jīng)過適宜的培養(yǎng)后可以形成膜片狀結構，可用于以后的實驗。
　　實驗二、軟骨細胞來源的細胞外基質支架材料的制備及其特征分析
　　目的：探討軟骨細胞膜片最佳的脫細胞方法，并分析其脫細胞前后組織結構和生物力學特征等有無變化。
　　方法：取實驗一培養(yǎng)的軟骨細胞膜片，然后分別在1％、5%和10%SDS中脫細胞處理24h，然后均再經(jīng)過1%TritonX-100和脫氧核糖核酸酶中去除細胞碎片和殘余的DNA

6、，在對其進行組織學、超微結構以及生物力學的檢測，分析其脫細胞前后特性有無變化。
　　結果：1%、5%和10%SDS三組處理方法均可比較徹底地去除細胞，但10%SDS會對細胞膜片的結構和特性造成很大的損害；而1%SDS既能比較徹底地脫細胞，又能在最大程度上維持細胞膜片原有的組織學結構和生物力學特征。
　　結論：1%SDS是本實驗中最佳的脫細胞方法，脫細胞后所獲得ECM可以用于下一步的實驗。
　　實驗三、軟骨細胞來源的細胞

7、外基質支架材料在兔膝關節(jié)骨軟骨缺損修復作用的初步探討
　　目的：探討ECM在軟骨缺損中的修復作用，并比較1%、5%和10%SDS三種脫細胞方法的優(yōu)劣。
　　方法：35只成年新西蘭大白兔隨機分為四組，分別為1%、5%、10%SDS和空白對照組，另外三只作為陽性對照；膝關節(jié)骨軟骨缺損模型建立后，分別植入已成功制備的ECM支架材料；在移植后的6周和12周時，分別安樂死犧牲掉實驗動物，取材進行大體學觀察、Micro-CT掃描和組織學

8、染色，并做大體學和組織學評分；比較各實驗組間有無差異。
　　結果：三個實驗組均可在一定程度上修復骨軟骨缺損，但大體學和組織學分析均證實1%SDS制備的ECM具有最好的修復效果，在移植12周后，缺損處已基本被新生的透明軟骨組織所充填；而且Micro-CT掃描也表明1%DS組中，軟骨下骨板再生情況最好。
　　結論：1%SDS是最佳的脫細胞方法，經(jīng)過1%SDS制備而來的ECM可以很好地修復骨軟骨缺損，該ECM支架材料可作為一種新型

9、的生物材料用于組織工程和再生醫(yī)學。
　　實驗四、軟骨細胞來源的細胞外基質支架材料修復作用機制的初步探討
　　目的：初步探討軟骨細胞來源的ECM支架材料在骨軟骨缺損修復中的作用機理。
　　方法：首先利用Transwell小室分析VEGF和BMSCs對內皮細胞的遷移有無影響，并通過添加VEGF抑制劑V1來觀察VEGF被抵消后，各實驗組中內皮細胞的遷移率有無變化；然后再分析 ECM對 BMSCs的遷移有無影響；最后再通過RT

10、-PCR和Western Blot分析ECM對BMSCs的分化有無影響。
　　結果：VEGF、BMSCs和軟骨細胞磚（Chondrocytes bricks, CB）等都對內皮細胞的遷移具有促進作用，而且BMSCs與最佳濃度的VEGF（10ng/ml）的促進作用相當，但當加入VEGF抑制劑V1后，內皮細胞遷移率明顯降低，說明BMSCs可通過分泌VEGF來募集更多的內皮細胞；同時ECM還可以促進BMSCs的遷移，而且RT-PCR和W

11、estern Blot也證明了軟骨細胞來源的ECM可以降低BMSCs的骨向分化和增加其軟骨向分化的能力。
　　結論：由于ECM或是富含ECM的CB具有很多生物活性成分，可以募集更多的干細胞達到缺損部位，啟動修復和再生過程；而募集而來的干細胞又可以促進更多的血管內皮細胞遷移而來，同時也會分泌更多的VEGF，從而有利于組織再生的形成和維持；而同時，ECM又可以促進 BMSCs的成軟骨向分化，抑制其骨向分化，最終達到了軟骨修復和再生。<

12、br>　　第二部分：基于細胞外基質的骨髓間充質干細胞膜片在骨組織工程中應用的初步探討
　　實驗一、骨髓間充質干細胞膜片復合富血小板纖維蛋白在兔顱骨極限缺損修復作用的初步探討
　　目的：我們前期實驗已經(jīng)在裸鼠體內證實了富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin, PRF）可以促進骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）膜片的成骨能力，本實驗旨在驗證B

13、MSCs膜片-PRF復合體在骨缺損修復中是否有作用。
　　方法：15只新西蘭大白兔隨進分為三組：空白對照組（只做顱骨極限缺損而沒有任何治療）；BMSCs膜片組（顱骨極限缺損+BMSCs膜片）；BMSCs膜片-PRF復合組：（顱骨極限缺損+BMSCs膜片-PRF復合體）。移植8周后對其進行Micro-CT掃描和組織學分析。
　　結果：空白對照組中僅有少量纖維組織覆蓋缺損，而BMSCs膜片組中雖然有少量骨形成，但不足以修復缺損；

14、但在BMSCs膜片-PRF復合組中，則可見大量新生的骨組織；新生骨體積/新生所有組織體積（ Bone volume/Total volume, BV/TV）和組織學半定量分析也證實了BMSCs膜片-PRF復合組中缺損修復的效果最好。
　　結論：BMSCs膜片-PRF復合體可以用于骨組織的缺損修復，該方法可作為一種新型的組織工程骨的構建方法，將來也許可以應用于臨床。
　　實驗二、骨髓間充質干細胞膜片復合脂肪來源干細胞構建組織工

15、程骨的實驗研究
　　目的：探討脂肪來源的間充質干細胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）能否促進BMSCs膜片的成骨能力。
　　方法：首先從同一供體身上分離培養(yǎng)ADSCs和BMSCs膜片，然后構建BMSCs膜片-ADSCs復合體，8只裸鼠隨機分為兩組：BMSCs膜片組，BMSCs膜片-ADSCs復合組；移植到裸鼠的背部皮下，移植8周后對其進行Micro-CT掃描和組織學分析。
　　結果

16、：BMSCs膜片組中有少量散在分布的骨小梁和骨島形成，但新生骨組織量很少；但在BMSCs膜片-ADSCs復合組中，則可見大量新生的骨組織和未完全成熟鈣化的軟骨組織；BV/TV和組織學半定量分析也證實了BMSCs膜片-ADSCs復合組中新生骨量更多。
　　結論：BMSCs膜片-ADSCs復合體可以用于組織工程骨的構建。該方法可作為一種新型的組織工程骨的構建方法，將來也許可以應用于臨床中。
　　實驗三、骨髓間充質干細胞膜片復合高

17、溫煅燒鴕鳥骨支架材料構建組織工程骨的實驗研究
　　目的：探討B(tài)MSCs膜片和高溫煅燒鴕鳥骨（Ostrich true bone ceramic,OTBC）支架材料用于構建組織工程骨的可能性。
　　方法：首先制備OTBC支架材料，分析其理化特征、生物相容性和生物降解性，然后將預先培養(yǎng)的BMSCs膜片與OTBC復合后移植到裸鼠背部皮下觀察期能否成骨，單純OTBC材料作為對照組；移植8周后，組織學分析觀察其成骨情況。
　　結