Nox4在順鉑誘導的急性腎損傷中的功能及作用機制研究.pdf

1、急性腎損傷是一組以突發(fā)和持續(xù)的腎功能下降為特征的臨床綜合癥，是引起繼發(fā)性慢性腎臟病、腎衰竭及住院患者死亡的重要原因。其病理過程主要包括腎小管上皮細胞發(fā)生炎癥、凋亡甚至是壞死等。前期的研究發(fā)現(xiàn)，順鉑誘導的急性腎損傷中存在ROS水平的變化，其來源存在多種途徑，其中NADPH oxidases的過度激活是氧化應激水平升高的重要機制。NADPH oxidases是一個包含膜結合細胞色素b558和細胞溶質調節(jié)蛋白的多組分酶。在腎臟組織中主要存在N

2、ox4亞型的表達，并且Nox4在腎臟疾病中的作用受到廣泛關注，例如，Nox4參與糖尿病腎病、腎腫瘤等腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。然而目前關于Nox4在順鉑誘導的急性腎損傷中的功能尚未見報道。本課題分別設計體內與體外實驗，研究在順鉑誘導的急性腎損傷中，Nox4的作用及可能涉及的調控機制，為防止急性腎損傷尋找新的策略。本課題的主要研究內容包括以下幾個部分：
　　1.體外實驗，用NAC預處理HK2細胞，檢測NAC抑制順鉑誘導的KIM-1蛋白與m

3、RNA、相關炎癥因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相關蛋白的表達
　　體外實驗以HK2細胞為研究對象，實驗分為三組：正常組；模型組用Cisplatin(20uM)處理細胞24h;NAC組用NAC(50uM)預處理12h，然后給予順鉑刺激24h。分別提取各組細胞的蛋白與RNA,通過Western blot、Real-time PCR、免疫熒光和流式細胞術方法，檢測ROS與腎損傷程度相關指標的水

4、平。結果表明，順鉑促進ROS表達的上調。同時，抑制ROS可以減輕順鉑誘導的腎損傷程度。提示ROS參與順鉑誘導的急性腎損傷過程。
　　2.在體內外實驗中，NADPH oxidases阻斷劑apocynin抑制順鉑誘導的KIM-1蛋白與mRNA、相關炎癥因子mRNA水平以及降低RIP-mediated necroptosis和凋亡相關蛋白的表達
　　1）體外實驗以HK2細胞為研究對象，實驗分為三組：正常組；模型組使用Cispla

5、tin(20uM)刺激細胞24h;Apo組先用apocynin(100uM)預處理12h后,給予順鉑刺激24h。通過Western blot、Real-time PCR、免疫熒光和流式細胞術方法檢測相關指標水平。結果表明，apocynin顯著地抑制順鉑誘導的腎損傷因子(KIM-1)的蛋白與RNA水平；同時降低順鉑引起的腎小管上皮細胞的凋亡與壞死；而且抑制RIP-mediated necroptosis相關蛋白(RIP1/RIP3/P-M

6、LKL)和凋亡相關蛋白(cleaved-caspase3)水平，并且抑制了炎癥相關因子(TNF-α/IL-1β/IL-6/MCP-1)的mRNA水平。提示NADPH oxidases參與順鉑誘導的急性腎損傷過程。
　　2）體內實驗，將小鼠分為正常組、Cisplatin組、Cispaltin+apocynin組，每組8只小鼠，正常組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水；Cisplatin組小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)，建立急性腎損傷模

7、型；Cisplatin+apocynin組小鼠腹腔注射apocynin(100mg/kg)，第二天給小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)。腹腔注射順鉑3天后處死小鼠采集血樣與收集腎組織，通過病理學、血清學、Western blot與Real-time PCR等方法檢測其相關指標。結果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，Cispaltin組病理學、血清學、Western blot、Real-time PCR等方法檢測指標均顯著增高；與Cisplatin組相

8、比，Cisplatin+apocynin組病理學、血清學、Western blot、Real-time PCR等方法檢測的指標均顯著降低，提示apocynin可以減輕順鉑誘導的急性腎損傷模型腎臟的損傷程度。
　　3.在體內外實驗中，Nox4促進順鉑誘導的KIM-1蛋白與mRNA、相關炎癥因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相關蛋白的表達
　　1）在體外實驗中，與正常組相比，cisplat

9、in刺激的HK2細胞組，顯著上調Nox4蛋白與mRNA水平；在體內實驗中，給小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)，建立急性腎損傷模型，三天后處死小鼠，通過IHC、Western blot和Real-time PCR方法發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的腎臟組織中，存在Nox4蛋白與mRNA水平的高表達。因此，本課題著眼于NADPH oxidases家族中Nox4在順鉑誘導的急性腎損傷中的研究。
　　2）在HK2細胞上，用shRNA

10、干擾技術靶向沉默Nox4，用順鉑(20uM)刺激HK2細胞，結果發(fā)現(xiàn)，沉默Nox4可以顯著抑制順鉑誘導的KIM-1蛋白與mRNA水平，另外沉默 Nox4可以抑制順鉑誘導的 RIP-mediated necroptosis相關蛋白RIP1/RIP3/P-MLKL以及凋亡相關蛋白cleaved-caspase3的表達，同時也顯著降低炎癥因子TNF-α、IL-1β與IL-8的水平。提示，Nox4通過RIP-mediated necroptos

11、is、凋亡與炎癥機制影響順鉑誘導的急性腎損傷過程。
　　3）在HK2細胞上，轉染Nox4質粒，用順鉑（20uM）刺激HK2細胞，結果發(fā)現(xiàn)，過表達Nox4可以促進順鉑誘導的KIM-1蛋白與mRNA水平，另外過表達Nox4可以促進順鉑誘導的RIP-mediated necroptosis相關蛋白RIP1/RIP3/P-MLKL以及凋亡相關蛋白cleaved-caspase3的表達，同時也可以顯著促進炎癥因子TNF-α、IL-1β與IL

12、-8的水平。提示，Nox4通過RIP-mediated necroptosis、凋亡及炎癥機制促進順鉑誘導的急性腎損傷過程。
　　4．在Nox4過表達細胞株上，ROS阻斷劑NAC抑制Nox4促進順鉑誘導KIM-1蛋白與mRNA、相關炎癥因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相關蛋白的表達
　　在Nox4過表達的細胞株上，給予NAC(50uM)預處理12h，隨后給予順鉑(20uM)刺激24h

13、,實驗被分為六組分別為Control組；Nox4 OE組；Control+Cispaltin組;Nox4 OE+Cispaltin組；Control+Cispaltin+NAC組;Nox4 OE+Cispaltin+NAC組。通過Westrn blot與Real-time PCR方法檢測相關指標。結果發(fā)現(xiàn)，NAC抑制Nox4對順鉑誘導的急性腎損傷的促進作用。提示，Nox4可能是通過ROS介導的RIP-mediated necroptos

14、is、凋亡及炎癥機制促進順鉑誘導的急性腎損傷過程。
　　5.給小鼠尾靜脈注射慢病毒包裝的Nox4 shRNA，在體沉默Nox4減輕順鉑誘導的小鼠功能與組織的損傷以及降低RIP-mediated necroptosis和凋亡相關蛋白的表達小鼠被隨機分為六組：Normal組；Vector組；Nox4 KD組；Normal+Cisplatin組；Vector+Cisplatin組；Nox4 KD+Cisplatin組；通過尾靜脈給 No

15、x4 KD和 Nox4 KD+Cisplatin組的小鼠注射慢病毒包裝的Nox4 shRNA，一周后，給對應模型組的小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)，建立急性腎損傷模型。三天后處死各組小鼠，取血樣和腎臟組織，通過組織學、血清學、Western blot和Real-time PCR等方法檢測相關指標。與Normal+Cisplatin組或Vector+Cisplatin組相比，Nox4 KD組中的PAS染色、KIM-1的蛋白與mRNA水

16、平、RIP-mediated necroptosis相關蛋白、凋亡相關蛋白的水平以及炎癥相關指標的水平均明顯降低，且差異存在統(tǒng)計學意義。提示，在體沉默Nox4可以降低順鉑誘導的急性腎損傷過程，即Nox4可能作為順鉑誘導的急性腎損傷的治療靶點。
　　6.在腫瘤細胞上沉默Nox4不影響腫瘤細胞對腫瘤的治療作用
　　在體外，建立Nox4沉默腫瘤細胞株(包括BEL7401，SGC-7901，C6細胞)。結果發(fā)現(xiàn)，沉默Nox4可以明顯