CDC42對胰島β細胞胰島素分泌的調節(jié)作用及其機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　糖尿病是由于體內胰島素分泌失衡或外周組織對胰島素抵抗導致胰島素絕對或相對不足，導致的機體血糖持續(xù)升高，進而繼發(fā)多組織器官損傷。CDC42是一個Rho家族GTPases的成員，有研究表明其具有調控胰島素分泌的作用。本課題旨在利用胰島β細胞特異性敲除CDC42小鼠模型進一步確定CDC42在葡萄糖刺激誘導胰島素分泌（GSIS）過程中的可能分子信號通路，從而為闡明CDC42在胰島β細胞分泌胰島素中的作用及其機制提供實

2、驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用生物信息學數(shù)據(jù)庫分析CDC42在小鼠主要器官和不同年齡時胰腺中的表達情況；
　　2.制備胰島β細胞特異性敲除CDC42小鼠，PCR鑒定小鼠基因型并分離胰島細胞Western blot分析小鼠是否構建成功；
　　3．分離小鼠的胰島以及制備抑制CDC42活性的MIN6細胞模型，分別檢測β細胞在低糖、高糖、KCl刺激后胰島素的分泌量并檢測胰島素基因的表達情況；
　　4.利用免疫熒

3、光技術，在熒光顯微鏡觀察CDC42和胰島素在不同條件刺激后的亞細胞分布，探討β細胞結構功能的變化情況；
　　5.機制分析：β細胞負載鈣離子探針（Fluo-3 AM），實時監(jiān)測細胞在不同條件刺激下胞內鈣的動態(tài)變化；Q-PCR分析鈣調節(jié)相關蛋白（NCX，SERCA,IP3R等）mRNA水平上的表達情況；Western blot檢測相關轉錄因子，進一步確定CDC42通過調控胞內鈣參與GSIS的作用機制。
　　結果：
　　1.

4、CDC42在小鼠內分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的組織中表達量較高，在胰腺中有一定的表達，且在胚胎14天左右，CDC42在胰腺組織表達明顯增加，在出生前達表達高峰，從出生至成年CDC42表達量維持一定的豐度；
　　2.基因型鑒定和Western blot確定小鼠基因型，結果顯示胰島β細胞特異性敲除CDC42小鼠，其胰島中的CDC42表達量顯著下調80％；
　　3.胰島β細胞特異性敲除CDC42的胰島β細胞下調GSIS中胰島素的分泌，抑制

5、CDC42活性同樣導致MIN6細胞胰島素分泌量減少；
　　4.在MIN6細胞系中抑制 CDC42活性導致胰島素顆粒在胞膜附近大量積聚，MIN6細胞出現(xiàn)分泌功能障礙的表型；
　　5.在β細胞中敲除CDC42或在MIN6細胞中抑制CDC42活性都減弱GSIS中[Ca2+]c的上調，且Q-PCR結果顯示Calmodulin、Calcineurin和IP3R基因等鈣調相關基因表達改變；同時敲除CDC42小鼠胰島組織中Foxa2表達明