mir-638通過對VEGFA的調控參與AML骨髓血管新生的研究.pdf

1、研究背景：
　　急性白血病是血液系統常見的惡性疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，盡管在過去的十年，對該疾病的診斷及治療方面有長足的進步，研究其發(fā)病機制和相應的治療策略仍然是血液學界重要的課題。以往的研究中，學者們大都關注白血病干細胞本身如細胞表面抗原變化、細胞遺傳學改變、基因的重組、突變等。近些年的研究資料顯示，骨髓造血微環(huán)境的改變也是參與其中的重要因素，白血病細胞在造血微環(huán)境中增殖，并不斷促進其發(fā)生變化，造血微環(huán)境的改變也為白血病細

2、胞提供了必要的生長條件，二者共同促進疾病的發(fā)生發(fā)展。骨髓血管新生是骨髓造因微環(huán)境改變的一項重要病理過程，其主要參與者包括血管內皮細胞、細胞因子、信號傳導通路及白血病干細胞本身。在這個過程中，參與其中的誘導因子表達上調，而抑制因子相對減弱，刺激循環(huán)內皮細胞向腫瘤周圍遷移、增殖，形成新生的血管。在眾多因子中，目前認為起關鍵作用的是血管內皮生長因子(VEGF)，它在血液系統腫瘤中的研究在不斷進展中。上世紀90年代，骨髓血管新生現象在多發(fā)性骨髓

3、瘤患者中被發(fā)現。隨后的研究發(fā)現，這種現象也同樣存在于急性白血病中。隨著分子生物學的飛速進展，人們對腫瘤治療的目標，已不再滿足于細胞和蛋白水平。一般認為，下調特定基因的mRNA表達策略是研究基因功能及有希望治療腫瘤的有效途徑。在分子水平控制基因表達已經成為重要的課題，miRNA的發(fā)現，給這個課題帶來了新的希望。
　　MicroRNAs(miRNAs)在轉錄后的調控起著重要的作用，其本身并不改變基因序列，而是與靶基因互相作用，通過上調

4、或抑制其表達而發(fā)揮調控作用。mi RNAs參與了真核生物幾乎所有的生物學過程，另外被發(fā)現的miRNAs多數位于脆性位點與癌癥相關的基因組區(qū)域，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。多個研究報告表明，miRNA參與了內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，miRNA表達譜往往是觀察各類疾病的生物學指標。許多miRNAs在血漿中能被檢測出來，隨著分子生物學技術的不斷成熟，其不僅可能成為一些疾病的生物學標記，還可能對疾病分型、評估療效及判斷預后有重要參考意義。
　　活

5、躍的血管生成是導致腫瘤患者快速復發(fā)和低生存率的重要原因。眾多miRNAs參與了這個過程。然而，確定miRNA與血管新生的關系是十分復雜過程，具有巨大的挑戰(zhàn)性，因為一個miRNA可能對應數百或甚至數千個目的基因，一種基因可以受數目眾多的miRNAs調控。根據數據庫基礎資料及前期我們對AML患者血漿中miRNAs表達譜的篩選研究，發(fā)現miR-638可能以“抑癌基因”角色參與腫瘤血管生成過程，然而其表達情況及具體機制尚未清楚。
　　研究

6、目的：
　　觀察急性髓系白血病患者骨髓血管新生情況，并對骨髓單個核細胞VEGFA-mRNA及miR-638水平進行檢測，根據臨床資料及檢測結果，分析二者在AML血管新生中可能的作用。進一步以白血病細胞系為研究對象，上調或下調miR-638表達水平，觀察VEGFAmRNA及蛋白表達變化。通過臨床觀察及基礎研究，探討miR-638、VEGFA在骨髓血管生成中的作用，并為尋找新的生物學標志物及新的治療方法奠定基礎。
　　研究方法：

7、
　　臨床研究:
　　1.選取77例急性髓系白血病患者及21列正常人為觀察對象，免疫組化法以Anti-vWF抗體標記微血管內皮細胞，檢測骨髓微血管密度(MVD);收集并分離骨髓單個核細胞，qTR-PCR法檢測miR-638、VEGFAmRNA表達情況。并分別分析MVD、VEGFAmRNA、miR-638與臨床特征的關系及三者表達水平相關性。
　　2.標準化療1周期后，評估緩解狀態(tài)，收集標本，再次檢測骨髓MVD及單個核細

8、胞VEGFAmRNA、miR-638表達水平，與治療前進行配對比較并分析相應的變化。
　　基礎研究:
　　1.以白血病細胞系K562、HL60和人臍靜脈細胞系HUVECs為研究對象，常規(guī)方法進行細胞培養(yǎng)，檢測miR-638、VEGFA表達情況。
　　2.上調/抑制miRNA-638表達實驗
　　質脂體轉染法轉染miR-638mimics及其抑制物miR-638 inhibitor于K562和HL60細胞株中，用q

9、RT-PCR法檢測轉染后細胞miR-638、VEGFAmRNA表達水平，應用Western blot法檢測VEGFA蛋白水平變化。
　　3.熒光素酶基因報告實驗
　　根據miR-638與VEGFA3'-UTR端結合位點設計引物。PCR擴增后雙酶切，連接到pmirGLO質粒載體中，定點突變VEGFA3'-UTR相應的種子序列并連接于載體中，由此分別構建了VEGFA野生型3'UTR和突變型3'UTR熒光素酶報告基因質粒，與miR

10、-638共轉染K562和HL60細胞，以Negative control作為陰性對照，培養(yǎng)48小時后加入底物發(fā)光，檢測熒光水平。
　　4.Transwell細胞共培養(yǎng)實驗
　　以內皮細胞HUVECs為觀察對象，應用Transwell小室（聚酯膜的孔徑為0.4μm）與轉染miR-638及miR-638inhibitor的K562、HL60細胞共培養(yǎng)，模擬白血病細胞對內皮細胞增殖的影響，應用MTT法檢測HUVECs的增殖情況。<

11、br>　　研究結果：
　　臨床研究結果:
　　1.應用免疫組化法檢測正常人及AML患者微血管密度(MVD)，高倍顯微鏡下(100×)觀察骨髓切片，發(fā)現vWF標記的AML患者骨髓微血管的形態(tài)與正常人存在差異。77例初發(fā)AML患者MVD明顯高于正常對照組，在伴有髓外浸潤者尤為顯著。經標準化療1周期后，評估療效，達CR者60人，NR者17人。化療后患者骨髓MVD仍偏高。所有患者治療前后進行配對t檢驗，治療后MVD較治療前下降;CR

12、組與NR組無統計學差異。
　　2.qRT-PCR法檢測AML患者VEGFA mRNA相對表達含量，結果顯示，初發(fā)AML患者與正常組比較明顯增高，且在高原始細胞比例組(BM-blasts＞50％)VEGFAmRNA表達水平明顯高于＜50％組?；?周期后，VEGFAmRNA表達水平仍偏高，與對照組比較有統計學意義;所有患者治療前后進行配對t檢驗，治療后VEGFAmRNA表達水平較治療前明顯下降。
　　3.qRT-PCR法檢測骨

13、髓單核核細胞miR-638表達，結果顯示，miR-638在初發(fā)AML表達下降，明顯低于正常對照組;經1周期治療后與初發(fā)時進行配對比較，其表達上調，有統計學差異;NR組miR-638表達水平仍偏低，與CR組比較有統計學差異。按臨床特征分析AML患者骨髓單個核細胞miR-638表達情況，其表達骨髓增生程度，白血病類型、有無髓外浸潤及細胞遺傳學改變無相關性。按骨髓原始細胞比例分組，AML患者骨髓原始細胞＞50％組表達水平明顯低于＜50％組，有

14、統計學差異。
　　4.將所有AML患者MVD與VEGFAmRNA及miR-638相對表達含量進行相關性分析，結果顯示，MVD與VEGFAmRNA呈顯著正相關(r=0.583，P＜0.05);miR-638與VEGFAmRNA呈顯著負相關(r=-0.389，P＜0.05)。
　　5.生存分析骨髓MVD偏低組患者總生存期較偏高組明顯延長，VEGFAmRNA及miR-638相對表達含量與生存期無明顯相關性。
　　基礎研究結果

15、:
　　1.miR-638在白血病細胞株K562、HL60中的表達水平較正常單個核細胞明顯減低。以miR-638mimics和miR-638 inhibitor轉染K562和HL60細胞株，轉染后應用qRT-PCR法進行檢測miR-638表達情況。轉染miR-638mimics的細胞株，其表達水平上調，明顯高于Negative Control組;而轉染miR-638inhibitor的細胞株，表達水平下調，與Negative Co

16、ntrol比較，有統計學差異。
　　2.轉染miR-638mimics的細胞，VEGFAmRNA和蛋白表達水平下降，較Negative Control組有明顯差異，而轉染miR-638inhibitor的細胞VEGFAmRNA和蛋白表達水平與Negative Control組相比較，無明顯差異。
　　3.熒光素酶報告基因實驗VEGFA-3'UTR野生型報告質粒與miR-638共轉染，熒光素酶活性較對照組及突變組比較明顯下降，

17、而突變型VEGFA-3'UTR報告質粒與miR-638共轉染，熒光素酶活性與對照組相比，無明顯差異。此結果證實，VEGFAmRNA的3'UTR端是miR-638的直接作用靶點，miR-638通過靶向VEGFA-3'UTR調節(jié)其蛋白表達，進而以揮其對血管生成的調控作用。
　　4.應用Transwell細胞共培養(yǎng)技術，觀察miR-638轉染后的白血病細胞系K562、HL60對靜脈內皮細胞的影響，并用MTT法檢測HUVECs的增殖能力。

18、結果顯示，K562細胞轉染miR-638mimcs組紫外光吸光度值(OD)較miR-638 inhibitor組及對照組明顯減低，miR-638 inhibitor組較對照組比較無明顯差異;HL60細胞轉染miR-638mimcs組OD值較miR-638 inhibitor組及對照組明顯減低，miR-638inhibitor組較對照組明顯升高，有統計學差異。
　　研究結論：
　　骨髓血管新生是急性髓系白血病重要的病理過程，骨